山东地区一株IBDV新型变异株的分离鉴定及致病性研究

作     者：刘德凤 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：魏凯

授予年度：2023年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：传染性法氏囊病病毒 新型变异株 萎缩 免疫抑制 

摘      要：鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是一种急性、高度传染性的免疫抑制病,给全球家禽养殖业造成了巨大的经济损失。其病原体为传染性法氏囊病病毒(IBDV),主要分为2种血清型,其中只有血清I型对鸡具有致病性。IBDV至今发生过两次变异,相继出现了经典株(Classical IBDV,c IBDV)、减毒株(Attenuated)、变异株(Variant IBDV,var IBDV)、超强株(Very virulent IBDV,vv IBDV)以及新型变异株(Novel variant IBDV,n Var IBDV)。n Var IBDV几乎不会引起死亡和明显的临床症状,但是会造成严重的免疫抑制,引起其他病原体的继发感染,导致鸡的死亡,造成不可忽视的经济损失。近年来,n Var IBDV在中国广泛流行,给IBD的防控带来了很大挑战。因此分离鉴定养殖场流行的IBDV并对毒株进行遗传进化分析及致病性分析具有十分重要的意义。本研究首先分离鉴定出一株IBDV,将其命名为IBDV-SD-1208,通过遗传进化分析得出该分离株属于n Var IBDV。本研究通过动物回归试验探究该分离株在鸡体内的复制规律,并检测SPF雏鸡感染IBDV-SD-1208后的组织病理学变化及免疫指标的变化。本研究为进一步了解n Var IBDV的致病机理及免疫抑制提供重要研究数据,也为下一步建立有效的防治措施提供理论依据。主要研究内容和结果如下:1、IBDV分离株的遗传进化分析本研究从山东省青州市某禽养殖场中采集到疑似IBDV感染的病料,通过检测确定为IBDV感染,且无其他常见病原感染,在鸡胚中分离纯化得到该毒株。通过与NCBI的IBDV VP2基因进行遗传进化分析,结果发现该分离株与近两年分离到的n Var IBDV SHG352的同源性最高,为97.8%,与其他亚型参考株的同源性低于94%。VP2序列的遗传进化树显示,分离株虽然与美国早期变异株(Variant E)位于同一分支,但与中国发现的n Var IBDV亲缘关系更加接近,表明该分离株属于n Var IBDV。通过比对氨基酸的序列发现,与vv IBDV和c IBDV相比,var IBDV存在13个特征氨基酸位点。而与var IBDV相比,分离株存在4个不同的氨基酸位点,这些突变均发生在抗原位点。除此之外,本研究还发现该分离株具有自身独特的突变位点,该位点位于高变区(HVR)投影域(P)的P结构环中,具有重要研究意义。2、IBDV分离株的致病性研究为了评估该毒株的致病性,通过点眼滴鼻途径用制备的病毒液感染14日龄SPF雏鸡,每只接种0.25 m L(6.940×10copies/m L),对照组中的雏鸡接种相同剂量的无菌磷酸盐缓冲液(PBS),观察并记录感染雏鸡的临床症状,并在1、3、5、7、9、11和14 dpi随机选取3只鸡进行称重并记录体重;剖检取胸腺、脾脏及法氏囊(BF)进行称重及计算免疫器官指数;将免疫器官固定,制备病理切片进行病理组织学观察,同时收取其他组织器官测定病毒载量。研究结果显示,雏鸡在攻毒后未见死亡,且无明显的临床症状,仅有少数有轻微腹泻,泄殖腔羽毛周围沾染粪便;攻毒影响了鸡的生长性能,造成免疫器官损伤;通过计算免疫器官指数,发现病毒造成BF和胸腺的萎缩,脾脏肿大;组织病理学结果也验证了病毒造成免疫器官的不同程度损伤,并使BF内淋巴细胞发生广泛凋亡;通过检测不同组织器官的病毒载量发现,病毒能够在鸡体内迅速复制,在3 dpi便达到峰值,随后稳定在较高的水平。为了评估该毒株诱导的免疫抑制,探究该毒株对NDV疫苗免疫效果的影响。在4 dpi,通过点眼滴鼻途径接种NDV疫苗,收集血清检测NDV抗体水平。结果显示,该分离株抑制了针对NDV抗原的免疫应答,降低了NDV抗体的HI滴度。表明分离株会诱发严重的免疫抑制,从而导致鸡群无法得到疫苗的良好保护。检测促炎性细胞因子m RNA的表达,结果发现促炎性细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的m RNA表达水平在感染急性期均有不同程度的升高,随后逐渐降低。该结果表明IBDV诱导的免疫损伤、炎症及细胞凋亡引起了鸡体内炎性细胞因子失衡。测定外周血淋巴细胞内CD4及CD8的数量及两者比值发现,在感染急性期CD4和CD8 T细胞数量急剧上升,随后降至低于对照组的水平,CD4/CD8的比值始终低于正常范围。表明分离株诱导的免疫损伤引起鸡出现免疫抑制。综上所述,本研究分离得到一株IBDV-SD-1208,遗传进化分析结果显示该毒株属于n Var IBDV。回归动物试验结果显示,鸡在感染病毒后呈现免疫抑制,外周血CD4/CD8比例失调,BF出现严重的病理变化,BF内促炎性细胞因子IL-1β等表达上调,导致组织细胞广泛