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2018年江苏省无锡市某地区儿童肠道携带ESBLs菌株状况调查分析

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疾病监测 2023年第1期38卷 39-44页

作者：王雅静袁敏齐倩倩李娟冯微宏管红霞无锡市疾病预防控制中心微生物检验科江苏无锡214023 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206

目的调查江苏省无锡市某地区儿童肠道携带超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株状况,为临床抗感染治疗提供合理使用抗菌药物的参考依据。方法收集2018年无锡市某实验幼儿园不同年级的健康儿童粪便样本131份和无锡市某住院儿童粪便样本107份,采... 详细信息

目的调查江苏省无锡市某地区儿童肠道携带超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株状况,为临床抗感染治疗提供合理使用抗菌药物的参考依据。方法收集2018年无锡市某实验幼儿园不同年级的健康儿童粪便样本131份和无锡市某住院儿童粪便样本107份,采用ESBLs筛查培养基初步筛选出产ESBLs的菌株,鉴定菌种类别并通过药敏试验分析耐药情况。结果共计筛选出112株产ESBLs的细菌,均为肠杆菌科类细菌,其中健康儿童粪便样本中分离到57株,住院儿童粪便样本中分离到55株,大肠埃希菌为主要分离菌株(89.28%)。健康儿童和住院儿童肠道内携带ESBLs的菌株对头孢菌素类的头孢唑啉、头孢呋辛、头孢曲松的耐药率均在90%以上;对氨基糖苷类的妥布霉素(χ^(2)=5.153,P=0.023)和头孢菌素类的头孢呋辛(χ^(2)=4.003,P=0.045)的耐药性上两者差异具有统计学意义(P<0.05)。筛选得到的112株菌株中,有92株细菌存在多重耐药的情况,多重耐药率高达82.12%。此外在住院儿童中检出1株对厄他培南耐药的耐碳青霉烯类的大肠埃希菌(MIC=2),在健康儿童中分离到一株对10类抗菌药物都不敏感的多耐药大肠埃希菌。结论无锡部分地区儿童肠道中普遍存在产ESBLs肠杆菌科细菌,且多重耐药现象较为严重,应该高度重视儿童抗菌药物的使用。

关键词：儿童超广谱β-内酰胺酶耐药分析抗菌药物多重耐药

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HIV-1整合酶的生物活性及酶动力学分析

HIV-1整合酶的生物活性及酶动力学分析

作者：冯微宏浙江大学

学位级别：硕士

[目的] 整合酶(integrase)是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)基因编码的蛋白质,由前期融合蛋白Pr160gag—pol经病毒自身编码的蛋白酶作用形成的产物。整合酶催化HIV逆转录合成的双链cDNA整合至宿主DNA上,在HIV复制... 详细信息

[目的] 整合酶(integrase)是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)基因编码的蛋白质,由前期融合蛋白Pr160gag—pol经病毒自身编码的蛋白酶作用形成的产物。整合酶催化HIV逆转录合成的双链cDNA整合至宿主DNA上,在HIV复制中起着关键的作用;由于正常宿主细胞没有整合酶,因此整合酶是设计HIV病毒抑制剂的良好靶点。在整合反应过程中,整合酶表现出四种活性:DNA结合、DNA 3'末端加工、末端转移(病毒DNA整合进宿主DNA)、去整合。在结合到双链平末端病毒DNA(供体DNA)后,整合酶切去3'端二个核苷酸—GT,然后切割宿主DNA的5'末端,并将病毒DNA整合进宿主DNA(受体DNA)。整合过程是可逆的,当整合DNA产物的类似物存在时,整合酶可将原整合产物重新分解为病毒DNA和宿主DNA部分。晶体结构研究显示:整合酶由三个结构域组成:1、N-末端结构域,包含一个锌指结构。2、中心区,包含酶的催化中心。3、C-末端结构域,非特异性结合DNA。因为以前普遍采用的方法使用带有放射性标记的病毒DNA底物,和整合酶共育后,经过变性胶电泳以及放射自显影,显示整合酶反应的产物。但这种实验都有耗时较长及放射线污染的缺点。我们旨在建立一种快速简便安全的体外筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法。 [方法] 包含HIV-1整合酶基因的重组质粒PT7-His-TX-WT-IN在*** BL21(DE3)中以包含体形式高效表达HIV-1整合酶(IN)。所获包含体经过洗涤,稀释复性,并通过镍柱纯化,获得高纯度及可溶的整合酶蛋白(IN)。我们采用一种基于Biotin-Avidin EILSA(BA-ELISA)的方法,测定分析整合酶的3'端酶切活性以及病毒DNA整合活性,并据此得到酶的动力学参数及整合酶的比活性,我们还分析了核糖体失活蛋白Ⅰ型(RIP Ⅰ)luffin-a对整合酶的抑制作用。

关键词：人类免疫缺陷I型病毒整合酶动力学抑制剂生物活性

一起GⅡ型诺如病毒混合感染疫情的病原鉴定及分析

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中国卫生检验杂志 2014年第11期24卷 1573-1575,1578页

作者：冯微宏肖勇无锡市疾病预防控制中心江苏无锡214023

目的对无锡1月份暴发的一起诺如病毒急性胃肠炎疫情进行病原基因测序分析,以鉴定其病原体,并对其基因进行进一步分型和分析。方法采用实时荧光定量RT-PCR法对10份疫情样本进行诺如病毒I型和II型检测,诺如病毒II型阳性样本经半巢氏RT-PC... 详细信息

目的对无锡1月份暴发的一起诺如病毒急性胃肠炎疫情进行病原基因测序分析,以鉴定其病原体,并对其基因进行进一步分型和分析。方法采用实时荧光定量RT-PCR法对10份疫情样本进行诺如病毒I型和II型检测,诺如病毒II型阳性样本经半巢氏RT-PCR扩增,然后进行产物纯化、测序,基因数据库比对,并用Clustal X、MEGA 5.1等分析软件构建序列进化树。结果 10份疫情样本中7份样本测出诺如病毒II型阳性,阳性样本经基因扩增、测序,所获序列经基因数据库比对后发现3个为GII.4型,其余为GII.7型,系统进化树分析显示本次病毒株的RdRp区和衣壳区的N/S区的同源分类相同,证明了没有重组株的存在。结论序列测定和分析结果证实这起无锡急性胃肠炎疫情是GII.4型和GII.7型诺如病毒混合感染所致。

关键词：诺如病毒混合感染基因分型

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两种水源性诺如病毒富集方法的比较

环境科学研究 2020年第6期33卷 1549-1554页

作者：冯微宏肖勇钱燕华许秋瑾南京医科大学公共卫生学院全球健康中心江苏南京211166 无锡市疾病预防控制中心江苏无锡214023 中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室北京100012

评估阳离子膜吸附-洗脱法和阴离子膜吸附-洗脱法在富集水源性诺如病毒(NV)过程中的病毒回收效果、消耗时间及使用成本,可以获得更适用于水源性诺如病毒实际监测工作的较优富集方法.以无锡市疾病预防控制中心保存的诺如病毒阳性标准质粒... 详细信息

评估阳离子膜吸附-洗脱法和阴离子膜吸附-洗脱法在富集水源性诺如病毒(NV)过程中的病毒回收效果、消耗时间及使用成本,可以获得更适用于水源性诺如病毒实际监测工作的较优富集方法.以无锡市疾病预防控制中心保存的诺如病毒阳性标准质粒为模板,采用荧光定量RT-PCR(反转录酶-聚合酶链反应)方法绘制病毒定量标准曲线,并应用于病毒的绝对定量.将含诺如病毒的粪便悬液先稀释成3个不同浓度,并加入灭菌水中,分别经过阴离子膜(硝酸纤维素滤膜)或阳离子膜(Nanoceram膜)吸附洗脱,最终相同体积洗脱液提取核酸后用荧光定量RT-PCR方法进行绝对定量,并进一步计算最终病毒回收率.结果表明:①样本病毒浓度为8×10^1~8×10^10 copies/μL时,病毒拷贝数的lg对数值与C t(荧光定量PCR中达到设定阈值所经过的循环数)呈线性关系.②随着样本病毒浓度的增加,阴离子膜法和阳离子膜法的病毒回收率都相应增加.③当检测样本中病毒浓度分别为8×10^1、4×10^2 copies/μL时,阴离子膜法回收率分别为22.2%±4.1%和36.8%±6.2%,阳离子膜法回收率分别为17.4%±1.5%和28.8%±6.1%,说明阴离子膜吸附-洗脱法对病毒的富集回收率显著高于阳离子膜吸附-洗脱法(P<0.05).研究显示,综合富集效果、耗费时间和成本等因素,阴离子膜吸附-洗脱法比阳离子膜吸附-洗脱法更适用于日常水源性诺如病毒的富集工作.

关键词：诺如病毒阴离子膜阳离子膜病毒富集

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美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ基因的克隆和表达

生物工程学报 2006年第4期22卷 592-597页

作者：黄建松詹金彪邹媛冯微宏浙江大学医学院生物化学与分子生物学教研室杭州310006

根据报道的cDNA序列,用RT-PCR的方法从美洲商陆夏季的叶片中克隆美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ(pokeweedantiviralproteinⅡ,PAP-Ⅱ)基因。将PAP-Ⅱ基因克隆至表达载体pET-28a(+)并在大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳分析结果表明,PAP-Ⅱ蛋白在BL21... 详细信息

根据报道的cDNA序列,用RT-PCR的方法从美洲商陆夏季的叶片中克隆美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ(pokeweedantiviralproteinⅡ,PAP-Ⅱ)基因。将PAP-Ⅱ基因克隆至表达载体pET-28a(+)并在大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳分析结果表明,PAP-Ⅱ蛋白在BL21(DE3)菌中获得表达,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体、复性和BBSTNTA树脂柱亲和层析纯化,获得高纯度的PAP-Ⅱ蛋白。用非放射性基于ELISA方法检测经过复性纯化后PAP-Ⅱ蛋白和蓖麻毒素A链(RTA)在体外对HIV-1整合酶有较强的抑制活性,其IC50分别约为303μg/mL,220μg/mL。用MTT法分析PAP-Ⅱ蛋白的生物学活性,复性纯化后蛋白对HEP-G2和Hela细胞有细胞毒作用,IC50分别为93μg/mL,102μg/mL,说明了PAP-Ⅱ蛋白能抑制肿瘤细胞的生长。构建的PAP-Ⅱ表达系统所表达的蛋白经复性后具有生物学活性,为进一步研究PAP-Ⅱ的抗HIV-1机制和抗肿瘤作用奠定了基础。

关键词：核糖体失活蛋白美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ HIV-1整合酶表达细胞毒性

ELISA法分析HIV-1整合酶的生物学活性

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浙江大学学报：医学版 2007年第2期36卷 179-184页

作者：冯微宏黄建松詹金彪浙江大学医学院生物化学与分子生物学教研室浙江杭州310058

目的:建立一种能够较好地分析HIV-1整合酶的生物学活性以及大规模地筛选整合酶抑制剂的方法。方法:HIV-1整合酶经表达复性及纯化后,采用一种基于Biotin-Avidin EILSA(BA-ELISA)的方法,使用化学发光底物测定分析整合酶的生物学活性,以及... 详细信息

目的:建立一种能够较好地分析HIV-1整合酶的生物学活性以及大规模地筛选整合酶抑制剂的方法。方法:HIV-1整合酶经表达复性及纯化后,采用一种基于Biotin-Avidin EILSA(BA-ELISA)的方法,使用化学发光底物测定分析整合酶的生物学活性,以及型核糖体失活蛋白luffin-a对整合酶的抑制作用。结果:1采用BA-ELISA法得到整合酶的比活性为54.92U/mg蛋白;2luffin-a对整合酶的半数抑制浓度为(0.63±0.026)μmol/L。结论:本实验所采用的基于BA-ELISA的方法能够较好地分析HIV-1整合酶的生物活性,适合于大规模体外HIV-1整合酶抑制剂的筛选。

关键词：整合酶类/遗传学人类免疫缺陷Ⅰ型病毒生物活性酶联免疫吸附测定

无锡一起诺如病毒感染性腹泻病原基因测序分析

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环境与健康杂志 2012年第4期29卷 342-344页

作者：冯微宏肖勇管红霞凌霞钱燕华无锡市疾病预防控制中心检验部江苏214023

目的对无锡一起诺如病毒急性胃肠炎疫情进行病原基因测序分析,以确证其病原体,并对其基因进行分型。方法采用荧光定量PCR法对74份疫情病例样本进行诺如病毒RNA检测,在阳性标本中取3份病毒样本和1份日常监测检出的诺如病毒Ⅱ型阳性标本,... 详细信息

目的对无锡一起诺如病毒急性胃肠炎疫情进行病原基因测序分析,以确证其病原体,并对其基因进行分型。方法采用荧光定量PCR法对74份疫情病例样本进行诺如病毒RNA检测,在阳性标本中取3份病毒样本和1份日常监测检出的诺如病毒Ⅱ型阳性标本,经RT-PCR扩增,然后纯化、测序和进化树分析。结果 74份疫情样本中的17份样本测出诺如病毒Ⅱ型RNA,阳性率23%;其中3株疫情病毒和1株日常哨点医院腹泻病监测所得的Ⅱ型诺如病毒的ORF1-ORF2连接区序列与DNA Data Bank of Japan(DDBJ)中的GII.4参考株Lordsdale病毒(Lordsdale virus,LV)同源性最高,达95%。结论序列测定结果证实这起无锡急性胃肠炎疫情是诺如病毒感染所致,其病毒基因型为GⅡ.4型。

关键词：诺如病毒半巢氏RT-PCR 进化树分析

2016-2018无锡市腹泻病疫情中诺如病毒的分子流行病学特征

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现代预防医学 2019年第6期46卷 983-987+999页

作者：冯微宏肖勇沙丹管红霞江苏省无锡市疾病预防控制中心

目的鉴定无锡市2016年3月-2018年3月急性腹泻病突发疫情中诺如病毒的感染流行情况,并对病原体进行分子特征研究。方法对疫情上送的暴发急性病例标本,采用荧光PCR初步判定病原体,常规RT-PCR检测诺如病毒RNA聚合酶和衣壳蛋白基因片段,并... 详细信息

目的鉴定无锡市2016年3月-2018年3月急性腹泻病突发疫情中诺如病毒的感染流行情况,并对病原体进行分子特征研究。方法对疫情上送的暴发急性病例标本,采用荧光PCR初步判定病原体,常规RT-PCR检测诺如病毒RNA聚合酶和衣壳蛋白基因片段,并进行序列测定和分子特征分析。结果在30起暴发疫情中共有162份标本经荧光PCR检测均为诺如病毒核酸阳性,其中154份标本RT-PCR检测判为GⅡ型诺如病毒,120份标本成功测序。测序结果显示,2016-2018年突发疫情中有5种基因型,分别是GⅡ.P16-GⅡ.2、GⅡ.P17-GⅡ.17、GⅡ.4;ydney2012、GⅡ.4;ew Orleans和GI.6,2017年之前以GⅡ.17病毒株流行为主,2017之后新的GⅡ.P16-GⅡ.2重组株成为无锡市病毒性腹泻疫情中的绝对优势株。结论诺如病毒是无锡市腹泻病疫情的最常见病原体,其最新的优势流行株是GⅡ.P16-GⅡ.2重组株,和全国趋势一致。

关键词：病毒性胃肠炎暴发诺如病毒分子特征

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芋螺睡眠肽结构和功能研究进展

浙江大学学报（医学版） 2007年第2期36卷 204-208页

作者：冯微宏詹金彪朱永平浙江大学医学院生物化学教研室浙江杭州310058 浙江大学医学院毒理学教研室浙江杭州310058

芋螺睡眠肽是一类与众不同的芋螺毒素,一级结构有高度同源性,它含有丰富的γ-羧基谷氨酸,和其他类芋螺毒素不同的是一般不含二硫键(除了芋螺睡眠肽-R),在结合金属离子后,构像中α-螺旋结构的成分会有不同程度地增加。芋螺睡眠肽是一类... 详细信息

芋螺睡眠肽是一类与众不同的芋螺毒素,一级结构有高度同源性,它含有丰富的γ-羧基谷氨酸,和其他类芋螺毒素不同的是一般不含二硫键(除了芋螺睡眠肽-R),在结合金属离子后,构像中α-螺旋结构的成分会有不同程度地增加。芋螺睡眠肽是一类非竞争性的N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体的选择性抑制剂,并且具有受体亚型特异性,颅内注射芋螺睡眠肽后,实验鼠会呈现一种睡眠样症状。序列及结构分析显示,正是芋螺睡眠肽序列中高度保守的氨基酸残基决定了它们的结构及功能,文中对其结构和功能的关系作了综合分析。

关键词：软体动物毒液类芋螺毒素类芋螺睡眠肽 γ-羧基谷氨酸 NMDA受体 α-螺旋结构