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青蛤I型溶菌酶和鲤鱼β-防御素的毕赤酵母表达系统构建及其重组DNA表达

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青蛤I型溶菌酶和鲤鱼β-防御素的毕赤酵母表达系统构建及其重组DN...

作者：冯付霭上海海洋大学

学位级别：硕士

青蛤(Cyclina sinensis)是无脊椎动物,生活在沿海地区,是我国重要的经济贝类之一,其作为滤食性的水产生物,拥有超强的抗逆能力。贝类物种进化水平比较低,虽然没有特异的免疫细胞和相关抗体,但是它们有自己的免疫机制:有血细胞和体液免... 详细信息

青蛤(Cyclina sinensis)是无脊椎动物,生活在沿海地区,是我国重要的经济贝类之一,其作为滤食性的水产生物,拥有超强的抗逆能力。贝类物种进化水平比较低,虽然没有特异的免疫细胞和相关抗体,但是它们有自己的免疫机制:有血细胞和体液免疫相互关联、相互作用,抵御外源异物的侵蚀。一些活性物质如:凝集素、抗菌肽、溶酶体酶(Lysozyme)都由血细胞或者血淋巴分泌。它们和异物的特异位点结合,发挥作用,裂解异物,一起维持本身机体环境的稳定。鲤鱼(Cyprinus carpio)是大宗淡水鱼养殖的一个重要品种,近来渔业高质量发展,除了养殖业水平提升以外,与鱼类自身免疫也有很大关系。众所周知,鱼类所生活的水环境有多种污染物质,在市场的长途运输中,也需要抵御可能出现的腐烂风险。由文献可知,鲤鱼本身产生的抑菌物质为防御素,主要在上皮组织中,如:体表、小肠等。同家族的大防御素成熟肽的N端的疏水性质保证了本身盐离子稳定性,且与细菌接触后,N末端域会驱动防御素组装成纳米网,可以捕获并杀死细菌,而成熟肽C端含有阳离子氨基酸残基,赋予了大防御素对革兰氏阴性菌的抗性功能。从之前的文献中可知,对于青蛤或者鲤鱼有些许研究,但未见其对鲤鱼防御素以及青蛤I型溶菌酶有真核表达方面的研究。同时我们知道,对贝类或者鱼类来说,其本身产生的抑菌物质的量不多,如果直接采用化学方法提取,则技术不成熟,且抑菌物质会有损失,投入的成本也很大。因此,对于I型溶菌酶以及鲤鱼β-防御素进行真核表达研究则恰到好处。首先,重组I型溶菌酶和β-防御素基因可以避免以上缺陷,且重组目的基因可以定向表达出目的溶菌酶和防御素,之后分泌出的目的蛋白不会形成包涵体,获取、纯化步骤较为简单,且技术较为成熟。本研究志在为水产品来源的天然抗菌物质提供在毕赤酵母中的重组DNA表达技术。本研究的第一阶段聚焦于青蛤I型溶菌酶基因的cDNA克隆以及重组表达载体的构建研究。通过RT-PCR获得编码青蛤I型溶菌酶的成熟肽基因,该基因的成熟肽有14个半胱氨酸残基,形成7对二硫键,氨基酸残基总数162个。设计引物,通过PCR扩增反应,在该基因成熟肽的N端添加Xho I、Kex 2;C端添加Xba I、6×His标签,最终获得目的基因“CslyI”。构建重组表达载体pPICZαA-CslyI,之后线性化,将其电转入毕赤酵母X-33中,通过高浓度的博来霉素进行筛选,以挑选出甲醇利用快速型高拷贝酵母转化子。提取阳性酵母转化子基因组,进行PCR验证。本研究第二阶段聚焦于青蛤I型溶菌酶在毕赤酵母中的重组表达以及其抑菌活性研究。将筛选得到的高拷贝酵母转化子在YPD培养基中复活,再转入BMMG培养基中积累菌体,48 h后离心、水洗,再转入BMMY培养基中,添加甲醇,在29℃、250 r/min条件下诱导表达72 h,之后离心培养液取上清。用滤膜对上清过滤除菌、再超滤浓缩至25倍,用Tricine-SDS-PAGE进行分析。之后再进行Western blot和MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,证明其为预期的重组目的蛋白CslyI。之后在同种条件下分不同诱导时间取上清,探究对重组蛋白表达量的影响,结果显示96 h的诱导时间相对较好。之后取阳性酵母转化子发酵上清对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)按照一定体积比例进行孵育,用平板菌落计数法探究重组目的蛋白的抑菌能力,结果显示,重组目的蛋白对以上三种细菌有较好的抑制作用;再将阳性酵母转化子发酵上清在不同温度下处理后,和细菌孵育一定时间,在酶标仪中检测三种细菌的细胞浓度,其结果可以反映出目的蛋白对三种细菌的抑菌性能,以研究目的蛋白的热稳定性。结果显示,经不同的温度处理后的发酵上清和未经处理后的组别其抑菌差异不显著,证明了重组目的蛋白的稳定性较好。本研究第三阶段聚焦于人工合成鲤鱼β-防御素在毕赤酵母中的重组DNA表达研究。本研究中的目的基因根据鲤鱼β-防御素登录号:JF343439.1,查找出其成熟肽基因序列号,并在成熟肽的N端、C端分别添加限制性酶切位点和信号肽识别位点,交由上海生工生物工程有限公司合成。鲤鱼β-防御素的基本信息如下:其目的基因编码的成熟肽有45个氨基酸残基,其中的6个半胱氨酸残基可以在空间上形成3对二硫键。在成熟肽基因的5’端成功添加有Xho I、Kex 2以及6×His标签,在成熟肽基因3’端有Xba I酶切位点,鲤鱼β-defensin的理论分子量为6.39 kD,pI为8.4。之后常规操作提取质粒、双酶切、和表达载体pPICZαA连接、电击转入毕赤酵母等,最后在29℃、250 r/min条件下添加1%体积比的甲醇进行诱导表达,用滤膜对发酵上清进行除菌、使用膜包进行浓缩,同样用Tricine-SDS-PAGE和Western blo

关键词：青蛤 I型溶菌酶鲤鱼 β-防御素重组DNA表达

青蛤I型溶菌酶在毕赤酵母中的重组DNA表达

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水产科学 2021年

作者：冯付霭赵震陶妍谢晶钱韻芳上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心

I型溶菌酶是无脊椎动物免疫系统中一种富含半胱氨酸的重要蛋白质免疫因子，具有良好的抗病原微生物功能。通过RT-PCR从青蛤闭壳肌中克隆到I型溶菌酶（CslyI）基因；以pPICZαA为表达载体、毕赤酵母X-33为工程菌，构建重组毕赤酵母菌株X-... 详细信息

I型溶菌酶是无脊椎动物免疫系统中一种富含半胱氨酸的重要蛋白质免疫因子，具有良好的抗病原微生物功能。通过RT-PCR从青蛤闭壳肌中克隆到I型溶菌酶（CslyI）基因；以pPICZαA为表达载体、毕赤酵母X-33为工程菌，构建重组毕赤酵母菌株X-33/pPICZαA-CslyI，经高质量浓度博莱霉素培养基筛选获得高拷贝重组菌株。该菌株在28 ℃、250 r/min条件下，经1%甲醇诱导表达72 h后获得蛋白质类表达产物。Western blot和MALDI-TOF/TOF质谱分析表明，该表达产物为预期的重组青蛤I型溶菌酶；进一步的抑菌试验证明该重组青蛤I型溶菌酶具有抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和副溶血性弧菌的活性，并且显示良好的热稳定性。本研究为无脊椎动物来源I型溶菌酶的制备提供了基于重组毕赤酵母的生物合成技术。

关键词：青蛤 I型溶菌酶重组毕赤酵母菌株蛋白质表达抑菌活性

“语言抽象层次”理论对于大学课堂讲授的启示

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中国大学教学 2024年第3期 92-96页

作者：桑塔杨晓霭兰州理工大学文学院

语言不完全等同于现实,忽略这一事实会造成许多混乱。“语言抽象层次”理论旨在发现这个问题并试图解决这一混乱。具体反映在使用语言过程中,要把握好恰当的语言抽象层次,尤其在高校课堂上,教师的语言抽象层次对于知识的口头传授至关重... 详细信息

语言不完全等同于现实,忽略这一事实会造成许多混乱。“语言抽象层次”理论旨在发现这个问题并试图解决这一混乱。具体反映在使用语言过程中,要把握好恰当的语言抽象层次,尤其在高校课堂上,教师的语言抽象层次对于知识的口头传授至关重要。在抽象层次上自由跳跃,这样才能在语言层面保证知识传授过程的最大效能。“语言抽象层次”理论对高校教师的知识储备、课前备课、讲授过程及语言风格都有重要的启示。

关键词：教学语言抽象层次讲授法

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“苹”乡遇知己

电影文学 2024年第8期 155-165页

作者：李静(编剧) 荆霭茜(编剧) 西安工商学院广播电视编导系西安工商学院

1.外景果园日清晨的果园,一阵清风吹过。风里包裹着清香和暖意,挂满枝头的苹果随风摇曳。周红侠坐在一片苹果树前,面前的手机正在直播,身后几位质朴的果农正忙着将刚摘的新鲜苹果小心翼翼地放进果筐。周红侠从桌上拿起一个苹果,大口咬下... 详细信息

1.外景果园日清晨的果园,一阵清风吹过。风里包裹着清香和暖意,挂满枝头的苹果随风摇曳。周红侠坐在一片苹果树前,面前的手机正在直播,身后几位质朴的果农正忙着将刚摘的新鲜苹果小心翼翼地放进果筐。周红侠从桌上拿起一个苹果,大口咬下去,脸上堆满笑意。周红侠:家人们,咱们家的苹果汁多脆甜,可以放心去拍!周红侠看到直播间人数已经突破1000人,弹幕飞速滚动着,她脸上的笑容更加灿烂。

关键词：苹果树红侠苹果汁果园直播

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基于语料库的英汉分裂构式对比研究

基于语料库的英汉分裂构式对比研究

作者：张瑞霭山东财经大学

学位级别：硕士

在英汉两种语言中,分裂构式是一种独特又常见的结构,其主要用于凸显话语中的某一种成分以达到强调的目的,受到国内外学者的广泛关注。已有研究主要关注于分裂构式在句法形式和功能上的差异,对英汉两种语言分裂构式结构和语义特征的分析... 详细信息

在英汉两种语言中,分裂构式是一种独特又常见的结构,其主要用于凸显话语中的某一种成分以达到强调的目的,受到国内外学者的广泛关注。已有研究主要关注于分裂构式在句法形式和功能上的差异,对英汉两种语言分裂构式结构和语义特征的分析较少。构式语法理论为分裂构式的研究带来了新的理论视角。根据构式语法的基本观点,构式是形式和意义的结合体,动词与构式之间的语义互动是构式语法理论的关键问题。通过采用构式搭配分析法,统计构式与动词的搭配强度统计分析构式的语义网络。本研究以英汉分裂构式作为研究对象,尝试回答以下问题:(1)哪些类别的形容词或名词更容易出现在英汉分裂构式中?(2)英汉分裂构式的原型、非原型义有哪些?语义网络是如何构建的?(3)英汉分裂构式共性和差异的认知理据性是什么?针对以上问题,本文英语语料来源于COCA语料库,汉语语料来源于BCC语料库,分别检索符合条件的英语It分裂构式和汉语“是……的”分裂构式,统计出相关频次信息。然后在R软件中运行Coll.analysis 4.0脚本,计算出所有出现在英汉分裂构式中的搭配强度,分析其语义特征范畴,并进一步探究英汉语分裂构式的语义网络及认知理据。本研究主要发现有:首先,由于句法限制,223个形容词与英语It分裂构式的搭配强度达到显著性差异,可以被分为10个语义类别,分别是:可能性,重要性和紧迫性,确定性和证据,期望和预期,评估和判断,情感和情绪,发现和知识,意见和信仰,变化和结果,时间和条件。汉语句法相对灵活,208个形容词或名词与汉语“是...的”分裂构式的搭配强度达到显著性差异,也可以被分为10个类别:概念基础,行动和结果,评估和判断,潜在性和可能性,困难和挑战,安全和保障,变化和转变,独特性,伦理和道德,发展和成功。其次,对英汉分裂构式和不同类别的形容词或名词进行语义分类,研究发现,英语It分裂构式的原型义是可能性、确定性和证据,汉语分裂构式的原型义则是独特性、发展和成功。最后,基于英汉分裂构式的原型语义和非原型语义的分析,英语It分裂构式的其他非原型义是通过多义联接建立起来的,而隐喻联接和多义联接共同成为了汉语语义扩展的方式。本研究基于构式语法的理论框架和构式搭配分析法,从新的理论视角和研究方法进一步对英汉分裂构式进行了探索,一定程度上弥补了现有研究的不足,同时也为跨语言对比和第二外语习得研究带来启发。

关键词：分裂构式构式搭配分析法英汉对比

大气中羟甲基磺酸与NO3·/HOO·/N2O相互作用的理论研究

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大气中羟甲基磺酸与NO3·/HOO·/N2O相互作用的理论研究

作者：焦霭箐曲阜师范大学

学位级别：硕士

基于黄芩汤治疗结直肠癌作用机制的网络药理学和分子对接分析

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吉林大学学报（医学版） 2024年第1期50卷 208-220页

作者：陈霭莹姜靖雯张慧广州中医药大学附属海南中医院海南海口570100 海南省中医院肿瘤科海南海口570100

目的:通过网络药理学和分子对接技术分析黄芩汤治疗结直肠癌(CRC)的潜在作用靶点,阐明其相关分子机制。方法:基于中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)构建黄芩汤活性成分和作用靶点数据集,通过GeneCards、人类在线孟德尔遗传(OMIM)... 详细信息

目的:通过网络药理学和分子对接技术分析黄芩汤治疗结直肠癌(CRC)的潜在作用靶点,阐明其相关分子机制。方法:基于中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)构建黄芩汤活性成分和作用靶点数据集,通过GeneCards、人类在线孟德尔遗传(OMIM)、药物遗传学和药物基因组学知识库(PharmGKB)等数据库构建CRC疾病相关靶点数据集。利用R软件、Cytoscape软件和STRING数据库构建药物-疾病靶点交集、黄芩汤中药复方调控网络和蛋白-蛋白互作(PPI)网络。利用R软件和Metascape平台进行基因本体论(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析。采用AutoDock和PyMol软件进行分子对接验证,评估配受体结合情况。结果:筛选黄芩汤有效活性成分136个,黄芩汤治疗CRC的潜在靶点242个,核心靶点18个,基于信号通路分析获得CRC密切相关核心关键靶点5个,分别为蛋白激酶B1 (AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶3 (MAPK3)、原癌基因FOS、肿瘤蛋白P53 (TP53)和原癌基因MYC。GO功能富集分析,主要参与多种细胞应激反应的生物过程。KEGG信号通路富集分析,潜在靶点在癌症通路高度富集;进一步对CRC核心靶点进行KEGG信号通路富集分析,主要涉及内分泌抵抗、细胞凋亡和表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)抵抗等通路。分子对接验证,黄芩汤活性成分槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮和柚皮素与AKT1、MAPK3、FOS、TP53及MYC均对接稳定,其中槲皮素与AKT1结合性最好。结论:黄芩汤活性成分可多靶点和多通路治疗CRC,核心配受体槲皮素和AKT1可能通过调控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B (AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路影响细胞增殖、分化和凋亡进程,发挥治疗CRC作用。

关键词：黄芩汤网络药理学分子对接结直肠肿瘤槲皮素

深化协同监督增强审计查出问题整改实效——访威海市人大常委会主任、党组书记贾瑞霭

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山东人大工作 2024年第1期 39-40页

作者：杨海滨贾瑞霭不详威海市人大常委会

近年来,威海市人大常委会主动适应新形势新要求,深入践行全过程人民民主重大理念,不断创新机制、优化流程,建立起审计查出问题整改全链条闭环监督体系,在推动依法行政、依法理财方面取得了新成效。记者:贾主任您好,围绕加强审计查出问... 详细信息

近年来,威海市人大常委会主动适应新形势新要求,深入践行全过程人民民主重大理念,不断创新机制、优化流程,建立起审计查出问题整改全链条闭环监督体系,在推动依法行政、依法理财方面取得了新成效。记者:贾主任您好,围绕加强审计查出问题整改监督,威海市人大常委会建立了什么机制?贾瑞霭:我们从制度建设入手,在全省率先出台《关于进一步加强审计查出突出问题整改情况监督的实施意见》,从健全监督机制、拓展监督内容、改进方式方法等4个方面作出明确规定,建立起审计整改监督协同机制,并以市委办文件予以转发,为市人大常委会依法开展监督工作提供了更加规范有力的制度支撑。

关键词：审计整改优化流程监督体系依法理财瑞霭协同机制问题整改创新机制

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小寒诗词名句解读

新读写 2024年第1期 46-48页

作者：陈霭生不详

1莫怪严凝切,春冬正欲交。【探源】出自唐代元稹《咏小寒十二月节》:“小寒连大吕,欢鹊垒新巢。拾食寻河曲,衔柴绕树梢。霜鹰延北首,雊雉隐聚茅。莫怪严凝切,春冬正欲交。”【释疑】小寒:“十二月节。月初寒尚小,故云。”(《月令七十二... 详细信息

1莫怪严凝切,春冬正欲交。【探源】出自唐代元稹《咏小寒十二月节》:“小寒连大吕,欢鹊垒新巢。拾食寻河曲,衔柴绕树梢。霜鹰延北首,雊雉隐聚茅。莫怪严凝切,春冬正欲交。”【释疑】小寒:“十二月节。月初寒尚小,故云。”(《月令七十二候集解》)大吕:古人把古乐十二律同十二月相配,大吕代表农历十二月。寻:沿着。河曲:河流弯曲的地方。

关键词：元稹十二律七十二候大吕严凝诗词名句小寒河曲