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白假丝酵母脂肪酶CaLIP10的毕赤酵母优化表达及酶的特性分析

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白假丝酵母脂肪酶CaLIP10的毕赤酵母优化表达及酶的特性分析

作者：侯淑琳华南理工大学

学位级别：硕士

脂肪酶具有广泛的理化性质，并在不断增长的现代生物技术中发挥着重要作用，而脂肪酶广泛来源于微生物，因而研究微生物脂肪酶具有重大意义。在本研究中，我们对白假丝酵母Candida albicans脂肪酶基因lip10进行了克隆和定点突变，并在... 详细信息

脂肪酶具有广泛的理化性质，并在不断增长的现代生物技术中发挥着重要作用，而脂肪酶广泛来源于微生物，因而研究微生物脂肪酶具有重大意义。在本研究中，我们对白假丝酵母Candida albicans脂肪酶基因lip10进行了克隆和定点突变，并在毕赤酵母中进行了优化重组表达，对表达产物进行了纯化和酶的特性分析。主要研究内容如下：通过PCR技术进行Calip10基因的克隆和定点突变。以Candida albicansATCC10231基因组为模板，PCR扩增得到脂肪酶基因并测序鉴定，确定该基因为lip10。利用重叠延伸PCR技术对基因lip10两处特殊Ser密码子位点CTG定点突变为普通Ser密码子TCT，以实现lip10在毕赤酵母表达系统中的异源表达。突变之后的lip10基因序列提交GenBank，编号为JN695238。构建毕赤酵母表达质粒pGAPZαA-Calip10和pGAPZαA-Calip10-dm，线性化后导入毕赤酵母进行重组表达，测得突变前后CaLIP10的酶活分别为2.05U/mL和4.92U/mL，突变之后酶活明显提高。采用中心组合设计-响应面分析法，对重组酵母的培养条件进行优化。响应面分析四因素（培养温度、培养基初始pH以及YPD培养基中葡萄糖浓度和酵母提取物浓度）对CaLIP10的酶活产量的影响，得出最优培养条件及培养基配比为：起始pH6.86，温度25.53℃，酵母提取物1.32%和葡萄糖浓度为3.48%，对应预测最大酶活为7.89U/mL，实验验证测得结果为8.06U/mL。实际值与预测值基本一致。优化后酶活（5.19U/mL）提高了55.30%。CaLIP10的纯化及酶的性质研究。采用阳离子交换层析一步法对重组表达的CaLIP10进行纯化，纯化倍数为5.68，回收率达86.01%。对纯化后的CaLIP10进行了酶的性质研究。结果表明，其可水解不同链长对硝基苯酚酯，其中水解pNPC（C8）时表现最大活力。CaLIP10的最适反应温度为25℃，pH为8.0，在碱性低温条件下较稳定。金属离子对CaLIP10酶活都表现不同程度的抑制作用。表面活性剂和有机溶剂会影响CaLIP10的酶活，CaLIP10对乙醇耐受性较好。CaLIP10可水解天然椰子油，可能具sn-2位选择性，对脂肪酸链长短无偏好性。

关键词：白假丝酵母脂肪酶定点突变表达酶的特性

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人多能干细胞来源的肾定向分化平台的构建

中国生物化学与分子生物学报 2022年第8期38卷 1098-1105页

作者：周冰蕊魏云亮梁婷何生冯志伟靳宁刘志贞赵虹侯淑琳于保锋解军山西医科大学生物化学与分子生物学教研室出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室山西医科大学第一医院影像科太原030001

肾是一种重要的人体器官,具有多种生理功能。然而,全球范围内约有10%的人口患有肾疾病。因此,建立一种接近人体肾的结构与功能的模型进行肾疾病的研究是十分必要的。多能干细胞体外定向诱导分化技术的兴起,为再生医学和精准医学领域注... 详细信息

肾是一种重要的人体器官,具有多种生理功能。然而,全球范围内约有10%的人口患有肾疾病。因此,建立一种接近人体肾的结构与功能的模型进行肾疾病的研究是十分必要的。多能干细胞体外定向诱导分化技术的兴起,为再生医学和精准医学领域注入了新的动力。本研究通过在体外条件下模拟体内肾发育的过程,将人多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞,通过体外定向诱导分化形成肾的祖细胞,进而建立肾的结构与功能单位:肾元。该研究通过激活WNT信号通路,同时抑制TGF-β信号通路,将人多能干细胞从多能态定向诱导至原条阶段。之后通过细胞自分化的能力使其发育至中间中胚层,再通过激活FGF信号通路,将其分化至肾祖细胞阶段。流式细胞检测结果显示,肾祖细胞占总细胞数的51.5%~61.9%。通过免疫荧光检测发现:分化得到的结构中包含肾小球足细胞、近端小管、远端小管等肾组织结构。该研究建立的肾体外分化方法,具有稳定性好、分化效率高、重复性好的特点。为研究人类肾的早期发育机制,肾疾病模型构建,以及药物筛选提供了一种新的方法。

关键词：人多能干细胞体外诱导分化肾的分化肾元

多阶段均值—标准差投资组合时间一致性策略研究

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华南师范大学学报（自然科学版） 2024年第2期56卷 91-99页

作者：张鹏崔淑琳华南师范大学经济与管理学院广州510006

文章运用标准差度量投资组合的风险,考虑交易成本、借贷约束和阈值约束等情况,提出了具有Vasicek随机利率和风险偏好的多阶段均值-标准差投资组合模型(V-M-SD)。基于博弈论的方法,将该模型转化为时间一致的动态优化问题,并使用离散近似... 详细信息

文章运用标准差度量投资组合的风险,考虑交易成本、借贷约束和阈值约束等情况,提出了具有Vasicek随机利率和风险偏好的多阶段均值-标准差投资组合模型(V-M-SD)。基于博弈论的方法,将该模型转化为时间一致的动态优化问题,并使用离散近似迭代法求解满足时间一致性的最优投资组合。最后,实证分析借贷约束、阈值约束和风险规避系数对V-M-SD模型的最优时间一致性策略的影响。研究发现,当其他约束条件保持不变时,在一定的阈值范围内,投资组合的终期财富分别与借贷约束、阈值约束、风险规避系数正相关、正相关、负相关;投资组合的单位风险水平分别与借贷约束、阈值约束、风险规避系数负相关、负相关、正相关。

关键词：多阶段投资组合均值-标准差时间一致性策略 Vasicek随机利率离散近似迭代法

柑橘病害近红外光谱判别模型及病害对理化指标影响

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农业工程学报 2024年第13期40卷 189-195页

作者：肖怀春吴茂隆栗琳琳尹淑琳孙旭东肖慧黎小芳鞠喜东华理工大学自然资源部环鄱阳湖区域矿山环境监测与治理重点实验室南昌330013 吉安市林业科学研究所吉安343011 华东交通大学机电与车辆工程学院南昌330013 江西中煤水利环保集团有限公司南昌330108

柑橘病害严重影响柑橘产量与品质,为进一步寻找叶片光谱与其理化指标变化规律,故将近红外光谱技术与化学计量学相结合探索柑橘病害光谱判别及病害对理化指标影响的可行性。利用便携式近红外光谱仪,获取柑橘正常、溃疡病和砂皮病3类叶片... 详细信息

柑橘病害严重影响柑橘产量与品质,为进一步寻找叶片光谱与其理化指标变化规律,故将近红外光谱技术与化学计量学相结合探索柑橘病害光谱判别及病害对理化指标影响的可行性。利用便携式近红外光谱仪,获取柑橘正常、溃疡病和砂皮病3类叶片光谱并测量理化指标值,开展光谱特性与理化指标规律分析,进行SPA(successive projections algorithm)与PCA(principal component analysis)变量筛选,结合RF(random forest)与LWPLS(locally weighted partial least squares)分别建立柑橘病害定性模型及理化指标定量模型。对比分析模型结果,发现基于原始光谱变量的LWPLS定性模型效果最佳,其判别准确率为94.03%。用401个光谱变量为输入,基于LWPLS的正常叶片SPAD值模型分析结果最优;虽正常、溃疡病和砂皮病3类叶片综合的LWPLS定量模型RMSEP较大为4.46%,但模型对叶片SPAD值具有较好的预测精度,R^(2)和RPD分别为0.93、2.19。研究表明,近红外光谱技术结合化学计量学判别柑橘病害及分析病害对叶片理化指标的影响具有一定可行性,可为柑橘病害实时现场检测提供重要科学参考。

关键词：病害模型近红外光谱柑橘 SPAD值实时检测

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考虑安全裕度的多方竞争电网扩展规划方法研究

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电测与仪表 2024年

作者：陈永淑洪海生唐娴周先华李荣琳广东电网有限责任公司广州供电局

电网扩展时往往在多方案下进行，不同方案给电网带来的收益与安全裕度并不一致。因此，提出一种平衡电网安全与投资收益的多方竞争规划方法。建立含多个投资人的电网扩展规划数学模型，采用纳什均衡的概念对电网规划博弈建模为具有平衡... 详细信息

电网扩展时往往在多方案下进行，不同方案给电网带来的收益与安全裕度并不一致。因此，提出一种平衡电网安全与投资收益的多方竞争规划方法。建立含多个投资人的电网扩展规划数学模型，采用纳什均衡的概念对电网规划博弈建模为具有平衡约束的平衡问题（equilibrium problem with equilibrium constraints， EPEC）。通过一系列线性化，将EPEC建模为混合整数线性规划问题。将能源短缺概率作为安全裕度评估标准，用于建模电网规划博弈中不确定运行参数的风险。通过安全裕度建模，可以得到在不同风险水平下的电网规划博弈的纳什均衡。电网投资博弈的结果可能不同于社会效益最大化基准模式。设计了支持预算机制来激励投资方，使得电网规划博弈的结果尽可能接近社会效益最大化结果。在两种规模的系统上对所提出的方法进行了评估，测试结果表明，所提出的方法可以使非合作博弈的均衡点向社会成本较小的点靠拢，验证了其有效性。

关键词：电网规划电力安全多方竞争纳什均衡

循环剪切作用下含可燃冰砂土-开采井界面强度弱化细观机制

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中国石油大学学报（自然科学版） 2024年第3期48卷 91-100页

作者：张玉侯劲宇栾雅琳陶子卓李建威东北大学深部工程与智能技术研究院辽宁沈阳110819 中国石油大学(华东)储运与建筑工程学院山东青岛266580 中冶赛迪工程技术股份有限公司重庆400013

含可燃冰砂土呈现埋藏浅、未成岩和强度低的特性。波浪循环荷载作用下含可燃冰砂土-开采井界面弱化特征显著,直接影响井口稳定。采用离散元方法,通过设置波浪循环荷载引起的井筒运动,研究含可燃冰砂土-开采井界面循环剪切力学特性,并从... 详细信息

含可燃冰砂土呈现埋藏浅、未成岩和强度低的特性。波浪循环荷载作用下含可燃冰砂土-开采井界面弱化特征显著,直接影响井口稳定。采用离散元方法,通过设置波浪循环荷载引起的井筒运动,研究含可燃冰砂土-开采井界面循环剪切力学特性,并从细观角度揭示界面宏观弱化机制。结果表明:可燃冰赋存导致含可燃冰砂土-开采井界面呈显著的强度弱化及剪胀体变特征,且可燃冰饱和度越高,弱化及剪胀越显著;原因在于近井区域含可燃冰砂土在循环剪切作用下形成胶结失效区域,大部分颗粒失去胶结约束,同时少部分胶结未失效的可燃冰颗粒与邻近颗粒形成较大粒径团簇,这些颗粒和团簇翻滚错动且无法充分传递荷载,导致界面产生强度弱化和剪胀体变;法向应力与剪切振幅的增大均会加剧界面试样可燃冰颗粒的胶结失效发展,强度弱化现象更为严重。

关键词：含可燃冰砂土-开采井界面循环剪切界面弱化胶结作用离散元

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基于机器学习预测的M-SV投资组合决策研究

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数学的实践与认识 2024年第5期54卷 70-82页

作者：张鹏李璟欣崔淑琳华南师范大学经济与管理学院广东广州510006

运用随机森林(Random forest,RF)、极端梯度提升(eXtremeGradient boosting,XGBoost)、支持向量回归(Support vectorreg ression,SVR)三种机器学习方法预测股票的收益率.运用预测的平均股票收益率,计算投资组合的期望收益、下半方差和... 详细信息

运用随机森林(Random forest,RF)、极端梯度提升(eXtremeGradient boosting,XGBoost)、支持向量回归(Support vectorreg ression,SVR)三种机器学习方法预测股票的收益率.运用预测的平均股票收益率,计算投资组合的期望收益、下半方差和下半协方差.考虑交易成本、借贷约束和交易量限制等,构建了基于机器学习预测的均值-下半方差(M-SV)投资组合模型,并运用不等式的旋转算法求解.最后,运用中证100指数成分股,进行样本内和样本外实证分析.研究结果表明,在样本内检验中SVR+M-SV模型的有效前沿水平相较于RF+M-SV、XGBoost+M-SV模型更高;在样本外检验中,三种机器学习混合方法+M-SV模型在收益、夏普比率、索提诺比率等的表现优于M-SV和等比例模型.

关键词：投资组合均值-下半方差随机森林极端梯度提升支持向量回归

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合成生物技术助力纳米颗粒疫苗理性设计时代的到来

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合成生物学 2024年第2期5卷 353-368页

作者：马雪璟郭畅华兆琳侯百东中国科学院生物物理研究所感染与免疫重点实验室北京100101 中国科学院大学北京100049 昌平实验室北京102206

纳米颗粒疫苗自1981年首次应用于人体以来,经历逾40年的发展历程,在临床应用方面已取得了极大成功。尤其是在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)等疫苗领域,纳米颗粒疫苗以显著的免疫原性和... 详细信息

纳米颗粒疫苗自1981年首次应用于人体以来,经历逾40年的发展历程,在临床应用方面已取得了极大成功。尤其是在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)等疫苗领域,纳米颗粒疫苗以显著的免疫原性和良好的安全性在遏制病毒传播和疾病防控方面发挥了不可替代的作用,为人类社会的健康安全作出了巨大贡献。自新型冠状病毒疫情爆发以来,迫切的防控需要进一步推动了包括纳米颗粒疫苗在内的各类新型疫苗技术的发展。然而,由于被相对更经验化的设计方式和更复杂的制备工艺制约,纳米颗粒疫苗临床转化应用的速度并不突出。因此,通过理性设计来提升纳米颗粒疫苗的研制效率和应用范围,正成为其未来发展的重要方向和关键目标。合成生物技术在纳米颗粒疫苗发展的过程中一直起着重要作用。近年来,新型合成生物技术的应用在推动纳米颗粒平台灵活性方面取得了显著进展,有望满足未来对抗原承载多样性的需求。本文首先综述了纳米颗粒疫苗发展的技术沿革与进展,从抗原自组装形成的纳米颗粒疫苗到抗原协助组装的纳米颗粒疫苗,再到抗原平台展示的纳米颗粒疫苗。其次,总结了纳米颗粒疫苗提高抗原淋巴引流效率、抗原增强B细胞信号活化、抗原具有独特的抗原提呈方式等增强抗原免疫原性的特殊作用。最后概括了纳米颗粒疫苗在新型冠状病毒流行中的转化应用,如新型冠状病毒刺突蛋白三聚体疫苗、协助组装的新冠纳米颗粒疫苗、标签偶联展示的新冠纳米颗粒疫苗。随着对免疫应答机理的深入研究和对抗原提呈新规律的发现,利用合成生物技术也将有助于充分发掘纳米颗粒疫苗的独特免疫功能、满足高难度疫苗研制的要求。因此有理由相信:在合成生物技术助力下,未来纳米颗粒疫苗将在新突发及重大传染性疾病的防控中做出更突出的贡献。

关键词：纳米颗粒疫苗合成生物学免疫应答抗原提呈新型冠状病毒肺炎

人分泌型磷脂酶A2 GIIE的E54突变及其对底物选择性的影响

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生物工程学报 2021年第7期37卷 2513-2521页

作者：侯淑琳白俊平陆昕张玉龙许婷婷解军山西医科大学基础医学院出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室山西太原030001 中国科学院广州生物医药与健康研究院呼吸疾病国家重点实验室广东广州510530

人分泌型磷脂酶A2 GIIE (Human secreted phospholipase A2 GIIE,hGIIE)通过发挥酶催化作用,参与炎症反应和脂代谢过程。为了揭示hGIIE的底物选择机制,文中对hGIIE进行了定点突变,采用毕赤酵母Pichia pastoris重组表达突变体蛋白,然后... 详细信息

人分泌型磷脂酶A2 GIIE (Human secreted phospholipase A2 GIIE,hGIIE)通过发挥酶催化作用,参与炎症反应和脂代谢过程。为了揭示hGIIE的底物选择机制,文中对hGIIE进行了定点突变,采用毕赤酵母Pichia pastoris重组表达突变体蛋白,然后通过阳离子交换和分子排阻两步法纯化蛋白,最后用等温微量热滴定仪测定酶活性。hGIIE的结构分析显示,氨基酸E54可能与GIIE的底物头基选择性有关,经过同源序列比对,拟将E54突变为丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)和赖氨酸(K)。突变体E54A、E54F和E54K在毕赤酵母组成型表达系统中实现重组表达,通过两步纯化,纯度达到90%以上。酶活性实验显示,突变体与底物1,2-二己酰卵磷脂(1,2-dihexanoyl-snglycero-3-phosphocholine,DHPC)和1,2-二己酰磷酸甘油(1,2-dihexyl phosphate glycerol,DHPG)的亲和力发生改变,其中突变体E54K与DHPG的Km值为突变前的0.39倍,亲和力明显增强;突变体E54F与DHPC的Km值为突变前的1.93倍,亲和力明显减弱。hGIIE的E54突变体蛋白与磷脂底物的亲和力发生明显改变,说明E54在hGIIE的磷脂底物选择性水解过程中起重要作用。

关键词：分泌型磷脂酶A2 GIIE 异源表达突变底物选择性