白假丝酵母脂肪酶CaLIP10的毕赤酵母优化表达及酶的特性分析

作     者：侯淑琳 

作者单位：华南理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨博

授予年度：2012年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：白假丝酵母 脂肪酶 定点突变 表达 酶的特性 

摘      要：脂肪酶具有广泛的理化性质，并在不断增长的现代生物技术中发挥着重要作用，而脂肪酶广泛来源于微生物，因而研究微生物脂肪酶具有重大意义。在本研究中，我们对白假丝酵母Candida albicans脂肪酶基因lip10进行了克隆和定点突变，并在毕赤酵母中 进行了优化重组表达，对表达产物进行了纯化和酶的特性分析。主要研究内容如下：通过PCR技术进行Calip10基因的克隆和定点突变。以Candida albicansATCC10231基因组为模板，PCR扩增得到脂肪酶基因并测序鉴定，确定该基因为lip10。利用重叠延伸PCR技术对基因lip10两处特殊Ser密码子位点CTG定点突变为普通Ser密码子TCT，以实现lip10在毕赤酵母表达系统中的异源表达。突变之后的lip10基因序列提 交GenBank，编号为JN695238。构建毕赤酵母表达质粒pGAPZαA-Calip10和pGAPZαA-Calip10-dm，线性化后导入毕赤酵母进行重组表达，测得突变前后CaLIP10的酶活分别为2.05U/mL和4.92U/mL，突变之后酶活明显提高。采用中心组合设计-响应面分析法，对重组酵母的培养条件进行优化。响应面分析四因素（培养温度、培养基初始pH以及YPD培养基中葡萄糖浓度和酵母提取物浓度）对CaLIP10的酶活产量的影响，得出最优培养条件及培养基配比为：起始pH6.86，温度25.53℃，酵母提取物1.32%和葡萄糖浓度为3.48%，对应预测最大酶活为7.89U/mL，实验验证测得结果为8.06U/mL。实际值与预测值基本一致。优化后 酶活（5.19U/mL）提高了55.30%。CaLIP10的纯化及酶的性质研究。采用阳离子交换层析一步法对重组表达的CaLIP10进行纯化，纯化倍数为5.68，回收率达86.01%。对纯化后的CaLIP10进行了酶的性质研究。结果表明，其可水解不同链长对硝基苯酚酯，其中水解pNPC（C8）时表现最大活力。CaLIP10的最适反应温度为25℃，pH为8.0，在碱性低温条件下较稳定。金属离子对CaLIP10酶活都表现不同程度的抑制作用。表面活性剂和有机溶剂会影响CaLIP10的酶活，CaLIP10对乙醇耐受性较好。CaLIP10可水解天然椰子油，可能具sn-2位选择性，对脂肪酸链长短无偏好性。