人分泌型磷脂酶A2 GIIE的E54突变及其对底物选择性的影响

作     者：侯淑琳 白俊平 陆昕 张玉龙 许婷婷 解军 Shulin Hou;Junping Bai;Xin Lu;Yulong Zhang;Tingting Xu;Jun Xie

作者机构：山西医科大学基础医学院出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室山西太原030001 中国科学院广州生物医药与健康研究院呼吸疾病国家重点实验室广东广州510530 

出 版 物：《生物工程学报》 (Chinese Journal of Biotechnology)

年 卷 期：2021年第37卷第7期

页      面：2513-2521页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 0836[工学-生物工程] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(No.31900917) 山西省博士科研启动基金(No.SD1812) 山西医科大学博士科研启动基金(No.XD1812) 山西省教育厅高校科技创新计划(No.2019L0423) 广东省科技计划项目(No.2015A030312017)资助 

主　　题：分泌型磷脂酶A2 GIIE 异源表达 突变 底物选择性 

摘      要：人分泌型磷脂酶A2 GIIE (Human secreted phospholipase A2 GIIE,hGIIE)通过发挥酶催化作用,参与炎症反应和脂代谢过程。为了揭示hGIIE的底物选择机制,文中对hGIIE进行了定点突变,采用毕赤酵母Pichia pastoris重组表达突变体蛋白,然后通过阳离子交换和分子排阻两步法纯化蛋白,最后用等温微量热滴定仪测定酶活性。hGIIE的结构分析显示,氨基酸E54可能与GIIE的底物头基选择性有关,经过同源序列比对,拟将E54突变为丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)和赖氨酸(K)。突变体E54A、E54F和E54K在毕赤酵母组成型表达系统中实现重组表达,通过两步纯化,纯度达到90%以上。酶活性实验显示,突变体与底物1,2-二己酰卵磷脂(1,2-dihexanoyl-snglycero-3-phosphocholine,DHPC)和1,2-二己酰磷酸甘油(1,2-dihexyl phosphate glycerol,DHPG)的亲和力发生改变,其中突变体E54K与DHPG的Km值为突变前的0.39倍,亲和力明显增强;突变体E54F与DHPC的Km值为突变前的1.93倍,亲和力明显减弱。hGIIE的E54突变体蛋白与磷脂底物的亲和力发生明显改变,说明E54在hGIIE的磷脂底物选择性水解过程中起重要作用。