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新型抗病毒蛋白2CVN融合基因的构建、表达与纯化

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中国生物制品学杂志 2007年第5期20卷 327-329页

作者：刘玉生金宁一李昌于芳佟敬山胡宁宁金洪涛李臻军事医学科学院十一所病毒室

目的构建新型抗病毒蛋白2CVN融合基因,增强CVN对病毒的结合性及中和活性,为进一步研究抗病毒药物奠定基础。方法采用PCR法,以pBluescriptⅡSK(+)-CVN质粒为模板,扩增CVN片段,在引物中引入Linker序列,将扩增的CVN片段与载体pET-CVN连接,... 详细信息

目的构建新型抗病毒蛋白2CVN融合基因,增强CVN对病毒的结合性及中和活性,为进一步研究抗病毒药物奠定基础。方法采用PCR法,以pBluescriptⅡSK(+)-CVN质粒为模板,扩增CVN片段,在引物中引入Linker序列,将扩增的CVN片段与载体pET-CVN连接,构建pET-2CVN原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行表达及产物纯化。结果表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,相对分子质量为29000,与理论预期值完全相符。凝胶成像分析表明目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的31.48%,纯化后的目的蛋白纯度达95%以上。结论已成功构建了2CVN融合基因,并获得高效表达。

关键词：抗病毒蛋白融合基因原核表达

二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达

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中国生物制品学杂志 2008年第3期21卷 169-173页

作者：佟敬山李昌金宁一于源华刘玉生于芳胡宁宁李霄张钰军事医学科学院十一所病毒室长春130062 长春理工大学生命科学技术学院长春130022

目的构建二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大... 详细信息

目的构建二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。对目的蛋白进行纯化和复性,并进行抗原结合活性及相对稳定性检测。结果重组载体pET-d41经酶切鉴定,证实构建正确。表达产物相对分子质量约为28000,与理论预期值完全相符。目的蛋白最高表达量可占菌体总蛋白的45.48%。经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后,蛋白纯度达95%以上,抗HIV-1 gp41 dsFv具有抗原结合活性,稳定性优于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

关键词：人免疫缺陷病毒 gp41 单链抗体原核表达稳定性

抗HIV-1外膜蛋白单链抗体基因的酵母表达和生物活性分析

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第12期23卷 1144-1146页

作者：李昌金宁一王宏伟刘玉生于芳佟敬山胡宁宁军事医学科学院军事兽医研究所病毒室吉林长春130062 南方医科大学免疫学教研室广东广州510515 长春理工大学吉林长春130022

目的:构建含抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体(scFv)基因的酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达,并检测其生物活性。方法:采用基因工程和重组DNA技术,从质粒pET28-scFv中切下目的基因片段,定向克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应... 详细信息

目的:构建含抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体(scFv)基因的酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达,并检测其生物活性。方法:采用基因工程和重组DNA技术,从质粒pET28-scFv中切下目的基因片段,定向克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应位点,构建重组酵母表达质粒pPIC9-scFv。BglⅡ线性化后,电转化入受体酵母菌GS115中,筛选阳性重组子,进行甲醇诱导表达,并用RT-PCR、SDS-PAGE、双抗体夹心Dot-ELISA法分析目的蛋白表达情况。结果:通过表型筛选、PCR鉴定获得阳性重组酵母工程菌,RT-PCR、SDS-PAGE分析表明目的蛋白得到很好表达,表达量可占培养液上清总蛋白量的18%,双抗体夹心Dot-ELISA法检测,表达产物能够特异识别重组HIV-1gp120抗原蛋白并与之发生特异性免疫反应,证明表达的重组scFv具有良好的抗体活性。结论:成功地实现了scFv基因的分泌性表达,为抗AIDS靶向治疗及进一步研究其抗HIV活性提供了依据。

关键词： HIV-1 外膜蛋白单链抗体酵母分泌表达

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腺病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用

腺病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用

抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：张钰金宁一李霄李昌佟敬山李群军事医学科学院军事兽医研究所

腺病毒载体是近年来被广泛应用的基因运载工具,它具有宿主细胞广泛、导入效率高、繁殖滴度高、不整合及相对安全等特点,在肿瘤基因治疗中发挥越来越大的作用。本文介绍了腺病毒载体的分子生物学特点和构建方法以及它在肿瘤基因治疗中的... 详细信息

腺病毒载体是近年来被广泛应用的基因运载工具,它具有宿主细胞广泛、导入效率高、繁殖滴度高、不整合及相对安全等特点,在肿瘤基因治疗中发挥越来越大的作用。本文介绍了腺病毒载体的分子生物学特点和构建方法以及它在肿瘤基因治疗中的应用。

关键词：腺病毒载体肿瘤基因治疗

来源： cnki会议评论

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免疫学杂志 2007年第5期23卷 531-534页

作者：于芳金宁一李昌刘玉生佟敬山胡宁宁金洪涛军事医学科学院十一所全军基因工程重点实验室

目的构建人源抗HIV-1单链抗体和白喉毒素融合基因的原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法通过PCR扩增,获得目前应用较多的DAB389基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAG... 详细信息

目的构建人源抗HIV-1单链抗体和白喉毒素融合基因的原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法通过PCR扩增,获得目前应用较多的DAB389基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定。结果酶切及DNA序列测定鉴定正确。SDS-PAGE和West-ern Blot分析证实,重组质粒可表达出相对分子质量为75200的蛋白,与DT-hs120融合基因分子量一致,其表达量约占菌体总蛋白的21%,表达形式主要为包涵体。结论成功构建了DT-hS120表达载体,并获得了高效表达。

关键词： HIV-1 单链抗体基因克隆原核表达

抗AIDS新型导向毒素CVN-LP1融合基因的构建及原核表达

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中国生物工程杂志 2007年第3期27卷 100-104页

作者：李昌金宁一刘玉生于芳金洪涛李臻佟敬山胡宁宁军事医学科学院军事兽医研究所基因工程实验室

目的:构建重组抗病毒融合蛋白CVN-LP1原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法:将已经构建好的pET-CVN和pET-LP1重组质粒,EcoRI和HindⅢ同时进行双酶切,保留LP1片段前端的linker序列。将所得的CVN片段连入pET-LP1载体上,构建pET-CVN-LP1融... 详细信息

目的:构建重组抗病毒融合蛋白CVN-LP1原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法:将已经构建好的pET-CVN和pET-LP1重组质粒,EcoRI和HindⅢ同时进行双酶切,保留LP1片段前端的linker序列。将所得的CVN片段连入pET-LP1载体上,构建pET-CVN-LP1融合表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western-blot鉴定表达产物。结果:重组载体pET-28a(+)-CVN-LP1经PCR及XhoI/EcoRI和EcoRI/HindIII双酶切鉴定,证实构建成功。将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物相对分子量约为20kDa,与理论大小一致。凝胶成像分析表明最高表达量可占菌体总蛋白的49.58%。SDS-PAGE、Western-blot分析表明目的蛋白得到了很好的表达。结论:构建了pET-CVN-LP1原核表达载体,并得到了目的融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础。

关键词：核糖体失活蛋白原核表达Cyanovirin-N LuffinP1

表达中国流行株HIV-1 gp120外膜蛋白靶细胞模型的建立

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中国生物工程杂志 2008年第4期28卷 12-16页

作者：李昌金宁一胡宁宁刘玉生佟敬山李霄金洪涛于芳吉林大学畜牧兽医学院长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所长春130062

利用pDispaly真核表达载体构建了用于表达中国流行株HIV-1gp120的真核表达质粒pD-120,通过脂质体转染法将其导入人宫颈癌细胞(HeLa),经G418反复加压筛选,直到细胞不再死亡为止,8代后获得稳定表达中国流行株HIV-1gp120蛋白的靶细胞复制模... 详细信息

利用pDispaly真核表达载体构建了用于表达中国流行株HIV-1gp120的真核表达质粒pD-120,通过脂质体转染法将其导入人宫颈癌细胞(HeLa),经G418反复加压筛选,直到细胞不再死亡为止,8代后获得稳定表达中国流行株HIV-1gp120蛋白的靶细胞复制模型HeLa-gp,SDS-PAGE,蛋白印迹与间接免疫荧光分析表明,重组蛋白得到很好表达,并具有良好生物活性,为抗AIDS/HIV治疗用基因工程制剂或靶向药物的活性检测奠定了坚实基础。

关键词： HIV.1 gp120 HeLa细胞模型建立

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西尼罗河病毒的研究进展

西尼罗河病毒的研究进展

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：胡宁宁金宁一李昌刘玉生佟敬山军事医学科学院军事兽医研究所

近年来,随着人类和自然界接触的越来越频繁,使得人兽共患的疾病有增长的趋势,西尼罗河病毒病就是近年来出现的一个典型的疾病,时至今日,他已经导致多人感染甚至死亡。本文就此病毒的一些生物学特性作一简要综述。

关键词：西尼罗河病毒西尼罗河病毒病脑膜脑炎

来源： cnki会议评论

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RNA干扰技术的研究进展

RNA干扰技术的研究进展