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人IL-1R Ⅰ胞外区毕赤酵母表达载体的构建和表达

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人IL-1R Ⅰ胞外区毕赤酵母表达载体的构建和表达

作者：陈炜烨广州中医药大学

学位级别：硕士

研究背景和目的白介素1受体Ⅰ型(IL-1 receptor type 1, IL-1R I)是IL-1功能受体,对多种免疫细胞的分化、生长、活化和增殖有重要的调节作用,并参与造血、压力反应及神经内分泌等多种生理过程。深入研究IL-1RⅠ有助于炎症疾病的发病机... 详细信息

研究背景和目的白介素1受体Ⅰ型(IL-1 receptor type 1, IL-1R I)是IL-1功能受体,对多种免疫细胞的分化、生长、活化和增殖有重要的调节作用,并参与造血、压力反应及神经内分泌等多种生理过程。深入研究IL-1RⅠ有助于炎症疾病的发病机制探讨和辅助诊断。生物体天然表达的IL-1RⅠ量都比较低,从中提取蛋白质进行结构、功能研究或临床应用难度大。本实验就利用毕赤酵母表达系统进行体外蛋白表达。毕赤酵母接近高等真核细胞,不含内毒素和其他有害物质,使用安全;繁殖速度快,对培养条件要求低,培养基价廉,生产成本低;在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内,又可在分泌信号作用下将蛋白分泌至胞外;具有强有力的易控制的醇氧化酶基因外源基因启动子,可对外源蛋白的表达进行严格调控;可对表达的外源蛋白进行翻译后的加工和修饰,从而使目的蛋白具有所应有的生物学活性。因此,本课题用毕赤酵母表达技术,表达IL-1RⅠ蛋白,为其功能研究或抗体制备提供物质基础。方法第一部分：人工L-1RⅠ胞外区基因克隆及其pPICZαA-sIL1RⅠ表达载体的构建。运用Trizol一步法提取人白细胞RNA;采用RT-PCR扩增IL-1RⅠ胞外区基因(sIL-1RⅠ),经双酶切连接构建重组质粒pPICZαA-sIL1RⅠ后转化大肠杆菌stbl3。PCR鉴定阳性克隆,并外送测序。第二部分：pPICZαA-sIL1RⅠ在毕赤酵母的表达。SacⅠ内切酶线性化pPICZαA-sIL1RⅠ重组表达载体;线性化质粒经电转仪转化GS115。PCR对阳性克隆进行鉴定,以及对GS115转化子表型筛选。确定表型后,对重组菌株进行甲醇诱导蛋白表达。提取菌体蛋白和上清液进行western blot检测以鉴定蛋白表达属于菌内表达还是分泌表达。结果第一部分：扩增的IL-1RⅠ胞外区基因约为1000bp;阳性克隆经PCR鉴定目的基因插入载体pPICZαA;基因测序结果经BLAST比对后显示基因长1008bp,碱基与IL-1RⅠ读码框编码区一一对应,提示插入片段正确。第二部分：pPICZαA-sIL1RⅠ重组载体线性化经电转仪成功转化酵母菌株GS 115;转化子表型筛选结果为甲醇诱导缓慢型Muts;对培养上清和菌体蛋白进行Western-Blot检测结果：上清没有检测到蛋白,在菌体内检测到蛋白。结论成功构建pPICZαA-sIL1RⅠ重组载体;pPICZαA-sIL1RⅠ成功转入酵母菌GS115;Western-Blot结果显示酵母经甲醇诱导表达出约38kDa的蛋白;sIL-1RⅠ蛋白为菌体内表达。

关键词： IL-1RⅠ 毕赤酵母表达系统 pPICZαA

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白介素-1受体Ⅰ型研究进展

广东医学 2009年第10期30卷 1560-1562页

作者：陈炜烨庄俊华黄宪章广东省中医院检验科广州510120

多效性细胞因子IL-1不仅参与胸腺细胞的增殖、B细胞的生长与分化、IL-2和IL-6的生成,而且参与炎症反应,神经紊乱,睡眠调节等.IL-1与靶细胞表面特异受体及IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)结合形成复合体,触发下游信号通路而产生生理效应.

关键词：白介素-1受体 IL-1受体 Ⅰ型细胞表面特异受体信号通路 IL-1RI 胸腺细胞细胞因子

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浅析南京城市规划及历史文化保护

管理观察 2010年第19期 262-263页

作者：陈炜烨南京晓庄学院生物化工与环境工程学院江苏南京210029

一座城市与一个人一样,有特色才能给人留下深刻的印象,才能有知名度。特色,既是城市释放的鲜明特质和沁人魅力,又是城市综合竞争力的核心元素和深层内蕴。而拥有着深厚的历史渊源不仅成为了历史文化名城的特色,反映着社会发展的脉络,也... 详细信息

一座城市与一个人一样,有特色才能给人留下深刻的印象,才能有知名度。特色,既是城市释放的鲜明特质和沁人魅力,又是城市综合竞争力的核心元素和深层内蕴。而拥有着深厚的历史渊源不仅成为了历史文化名城的特色,反映着社会发展的脉络,也成为了人类的宝贵财富。可随着城市的发展,城市规划的产生,历史与发展的问题日益突出.本文从古都南京入手,着重阐述了城市规划与历史文化名城保护的重要意义。

关键词：南京市历史文化名城保护措施

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国际排球科研演进历史

文体用品与科技 2012年第4X期 71-72页

作者：杨东亮陈炜烨武汉体育学院研究生部

运用文献计量学最前沿的知识图谱分析方法对来自SCI数据库的排球科学引文数据进行文献共被引分析,得到了排球学科的发展演变过程。得到排球领域的发展与演进可分为三个时期:早期探索期、蓬勃发展期和继续发展期。为我国排球科研工作者... 详细信息

运用文献计量学最前沿的知识图谱分析方法对来自SCI数据库的排球科学引文数据进行文献共被引分析,得到了排球学科的发展演变过程。得到排球领域的发展与演进可分为三个时期:早期探索期、蓬勃发展期和继续发展期。为我国排球科研工作者了解国际排球研究动态提供了一定的参考价值。

关键词：知识图谱 citespace 排球计量分析

重组人白介素1受体Ⅰ型细胞外基因在毕赤酵母的表达

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南方医科大学学报 2010年第8期30卷 1841-1843页

作者：吕渭辉庄俊华陈炜烨张战锋黄宪章广州中医药大学DME中心广东广州510405 广州中医药大学第二临床医学院广东广州510120

目的构建白介素1受体Ⅰ型细胞外基因(可溶性白介素1受体Ⅰ型,sIL-1RⅠ)的pPICZαA-sIL-1RⅠ重组表达载体,利用毕赤酵母表达技术表达sIL-1RⅠ蛋白。方法采用RT-PCR技术扩增基因sIL-1RⅠ,经酶切连接构建重组质粒pPICZαA-sIL-1RⅠ,转化***... 详细信息

目的构建白介素1受体Ⅰ型细胞外基因(可溶性白介素1受体Ⅰ型,sIL-1RⅠ)的pPICZαA-sIL-1RⅠ重组表达载体,利用毕赤酵母表达技术表达sIL-1RⅠ蛋白。方法采用RT-PCR技术扩增基因sIL-1RⅠ,经酶切连接构建重组质粒pPICZαA-sIL-1RⅠ,转化***13;阳性克隆经测序成功后,把pPICZαA-sIL-1RⅠ重组质粒电转入毕赤酵母菌株GS115,PCR对阳性克隆进行鉴定,以及对GS115转化子表型筛选。确定表型后,对重组菌株进行甲醇诱导蛋白表达。提取菌体蛋白和上清液进行Westernblotting检测以鉴定蛋白表达属于菌内表达还是分泌表达。结果 pPICZαA-sIL-1RⅠ重组质粒构建成功;pPICZαA-sIL-1RⅠ成功电转入酵母菌GS115;转化子表型筛选结果为甲醇诱导缓慢型Muts;对培养上清和菌体蛋白进行Westernblotting检测结果:上清没有检测到蛋白,在菌体内检测到蛋白。结论成功运用毕赤酵母表达体系表达sIL-1RⅠ蛋白,为sIL-1RⅠ的研究和应用提供实验基础。

关键词：白介素1受体I型重组质粒毕赤酵母

尿素参考方法的建立及其在正确度评价中的应用

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实用医学杂志 2014年第3期30卷 474-476页

作者：柯培锋王建兵陈炜烨林海标黄宪章郑松柏广东省中医院检验科广州市510120

目的:建立血清尿素参考方法,评价不同检测系统尿素测量结果的正确性。方法:根据美国CDC推荐尿素参考方法复现本实验室参考方法,与5个尿素测量常规检测系统进行方法间比对,运用改良的Blant-Altman图形法评价各常规系统与参考方法测量结... 详细信息

目的:建立血清尿素参考方法,评价不同检测系统尿素测量结果的正确性。方法:根据美国CDC推荐尿素参考方法复现本实验室参考方法,与5个尿素测量常规检测系统进行方法间比对,运用改良的Blant-Altman图形法评价各常规系统与参考方法测量结果的一致性。结果 :参考方法总不精密度0.999 8),各常规系统与参考方法测量结果的回归方程分别为:Y=1.011 4X-0.037 5,Y=0.982 9X+0.008 1,Y=0.995 9X-0.011 9,Y=0.932 2+0.071 7,Y=0.953 1X-0.043 3,其中X和Y分别代表参考方法与常规系统的测量结果。与参考方法比较,干式生化系统(系统4、5)表现出较明显的负偏倚,而其他系统与参考方法结果一致。结论:尿素参考方法在实验室已复现且性能符合要求,应重视干式生化系统尿素测定结果与参考方法间存在的差异。

关键词：尿素参考方法正确度检测系统

POCT仪器与全自动生化分析仪C反应蛋白检测结果的比对

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广东医学 2014年第1期35卷 110-111页

作者：卓兰云黎小琼何敏陈炜烨彭玉莲马骥欧阳芬广东省中医院检验科广州510120

目的探讨POCT仪器I-reader干式免疫分析仪与罗氏Modular PPI全自动生化分析仪测定C反应蛋白(CRP)的结果是否具有可比性。方法参照CLSI EP9-A2文件要求进行方法间的比对分析。结果两个检测系统测定CRP的精密度良好,Modular PPI与I-reade... 详细信息

目的探讨POCT仪器I-reader干式免疫分析仪与罗氏Modular PPI全自动生化分析仪测定C反应蛋白(CRP)的结果是否具有可比性。方法参照CLSI EP9-A2文件要求进行方法间的比对分析。结果两个检测系统测定CRP的精密度良好,Modular PPI与I-reader血清测定的回归方程为y=0.916x+0.442 1,r2=0.957 7。全血测定的回归方程为y=1.128 3x+2.562 4,r2=0.950 2。通过校正公式:全血CRP(校正后)=全血CRP(校正前)×(1-0.425)/(1-实测Hct)校正后,y(校正后)=0.988 3x+1.036 7,r2=0.977 2。两种检测方法间系统误差最高的是9.2%,小于1/2 CLIA'88 12.5%的要求。结论两种检测系统测定CRP的结果具有可比性,适合临床应用。患者红细胞压积异常时,通过校正公式校正,可提高结果的可比性。

关键词：即时检验 C反应蛋白比对试验

尿轻链在检测系统性红斑狼疮肾脏损伤中的应用

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广东医学 2012年第24期33卷 3716-3718页

作者：柯培锋陈炜烨徐建华何敏赖圣明徐宁广东省中医院检验科广州510120 中山大学附属第六医院检验科广州510655

目的评估尿轻链在系统性红斑狼疮(SLE)肾脏损伤中的诊断价值。方法选取临床诊断为SLE的患者39例,结合肾脏损伤情况,分为两组:肾脏损伤组(LN组,n=20)与非肾脏损伤组(非LN组,n=19)。采用散射免疫比浊法原理检测尿免疫球蛋白κ轻链(kapU)... 详细信息

目的评估尿轻链在系统性红斑狼疮(SLE)肾脏损伤中的诊断价值。方法选取临床诊断为SLE的患者39例,结合肾脏损伤情况,分为两组:肾脏损伤组(LN组,n=20)与非肾脏损伤组(非LN组,n=19)。采用散射免疫比浊法原理检测尿免疫球蛋白κ轻链(kapU)、尿免疫球蛋白λ轻链(lamU)以及尿免疫球蛋白G(Ig-GU)、尿微量白蛋白(mALbU),尿α1-微球蛋白(α1-MU)、尿α2-微球蛋白(α2-MU)、尿转铁蛋白(TrfU),比较两组患者尿轻链水平并分析其与其他指标间的相关性。结果 SLE患者LN组kapU为55.90(33.73,216)mg/L,高于非LN组的6.21(5.41,15.30)mg/L,差异有统计学意义(P<0.001);SLE患者LN组lamU为30.30(19.43,92.10)mg/L,高于非LN组的3.24(2.56,4.75)mg/L,差异有统计学意义(P<0.001);SLE患者LN组的其他指标的检测结果都高于非LN组,差异有统计学意义(P<0.001);相关分析显示,kapU与lamU呈高度相关(rs=0.94,P<0.001);尿轻链kapU、lamU与α1-MU呈高度相关(rs=0.95,rs=0.90,P<0.001);kapU、lamU与β2-Mg相关(rs=0.74,rs=0.68,P<0.001);kapU、lamU与IgGU、mALbU、TrfU相关(rs=0.81,rs=0.67,rs=0.73和rs=0.89,rs=0.77,rs=0.81,P<0.01)。结论尿轻链kapU、lamU可以作为评价SLE肾脏损伤的指标,尤其作为肾小管损伤的评价指标。

关键词：系统性红斑狼疮 kapU lamU 肾损伤

pPICZαA-CDK2重组质粒的构建及表达

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实用医学杂志 2011年第16期27卷 2917-2919页

作者：黄宪章张战锋谢诗园李朝霞李林陈炜烨何敏庄俊华广东省中医院检验科广州市510120 广州医学院检验系 510120 中山大学附属第三医院检验科广州市510630

目的:构建含有细胞周期依赖性激酶2(CDK2)的胞外分泌型pPICZαA-CDK2重组质粒,利用毕赤酵母表达体系表达CDK2蛋白。方法:从人白细胞中提取总RNA,逆转录后采用聚合酶链反应扩增出CDK2基因,并将其插入pPICZαA质粒,构建重组质粒,化学法转... 详细信息

目的:构建含有细胞周期依赖性激酶2(CDK2)的胞外分泌型pPICZαA-CDK2重组质粒,利用毕赤酵母表达体系表达CDK2蛋白。方法:从人白细胞中提取总RNA,逆转录后采用聚合酶链反应扩增出CDK2基因,并将其插入pPICZαA质粒,构建重组质粒,化学法转化大肠杆菌JM109进行克隆。重组质粒pPICZαA-CDK2转化毕赤酵母菌株GS115,甲醇诱导酵母细胞进行蛋白表达,SDS-PAGE和Western-Blot鉴定蛋白表达情况及抗原性。结果:PCR电泳及DNA测序证实CDK2基因已正确克隆到表达载体中;重组质粒转入酵母菌GS115,酵母经甲醇诱导表达后经SDS-PAGE检测发现在34000左右有条带,Western-Blot检测发现有与CDK2单抗结合蛋白。结论:成功构建重组质粒,初步判断CDK2全长蛋白在毕赤酵母中表达成功且抗原性良好。

关键词：细胞周期蛋白依赖激酶2 重组质粒毕赤酵母