人IL-1R Ⅰ胞外区毕赤酵母表达载体的构建和表达

作     者：陈炜烨 

作者单位：广州中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：庄俊华

授予年度：2010年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：IL-1RⅠ 毕赤酵母表达系统 pPICZαA 

摘      要：研究背景和目的 白介素1受体Ⅰ型(IL-1 receptor type 1, IL-1R I)是IL-1功能受体,对多种免疫细胞的分化、生长、活化和增殖有重要的调节作用,并参与造血、压力反应及神经内分泌等多种生理过程。深入研究IL-1RⅠ有助于炎症疾病的发病机制探讨和辅助诊断。 生物体天然表达的IL-1RⅠ量都比较低,从中提取蛋白质进行结构、功能研究或临床应用难度大。本实验就利用毕赤酵母表达系统进行体外蛋白表达。毕赤酵母接近高等真核细胞,不含内毒素和其他有害物质,使用安全;繁殖速度快,对培养条件要求低,培养基价廉,生产成本低;在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内,又可在分泌信号作用下将蛋白分泌至胞外;具有强有力的易控制的醇氧化酶基因外源基因启动子,可对外源蛋白的表达进行严格调控;可对表达的外源蛋白进行翻译后的加工和修饰,从而使目的蛋白具有所应有的生物学活性。 因此,本课题用毕赤酵母表达技术,表达IL-1RⅠ蛋白,为其功能研究或抗体制备提供物质基础。 方法 第一部分：人工L-1RⅠ胞外区基因克隆及其pPICZαA-sIL1RⅠ表达载体的构建。运用Trizol一步法提取人白细胞RNA;采用RT-PCR扩增IL-1RⅠ胞外区基因(sIL-1RⅠ),经双酶切连接构建重组质粒pPICZαA-sIL1RⅠ后转化大肠杆菌stbl3。PCR鉴定阳性克隆,并外送测序。 第二部分：pPICZαA-sIL1RⅠ在毕赤酵母的表达。SacⅠ内切酶线性化pPICZαA-sIL1RⅠ重组表达载体;线性化质粒经电转仪转化GS115。PCR对阳性克隆进行鉴定,以及对GS115转化子表型筛选。确定表型后,对重组菌株进行甲醇诱导蛋白表达。提取菌体蛋白和上清液进行western blot检测以鉴定蛋白表达属于菌内表达还是分泌表达。 结果 第一部分：扩增的IL-1RⅠ胞外区基因约为1000bp;阳性克隆经PCR鉴定目的基因插入载体pPICZαA;基因测序结果经BLAST比对后显示基因长1008bp,碱基与IL-1RⅠ读码框编码区一一对应,提示插入片段正确。 第二部分：pPICZαA-sIL1RⅠ重组载体线性化经电转仪成功转化酵母菌株GS 115;转化子表型筛选结果为甲醇诱导缓慢型Muts;对培养上清和菌体蛋白进行Western-Blot检测结果：上清没有检测到蛋白,在菌体内检测到蛋白。 结论 成功构建pPICZαA-sIL1RⅠ重组载体;pPICZαA-sIL1RⅠ成功转入酵母菌GS115;Western-Blot结果显示酵母经甲醇诱导表达出约38kDa的蛋白;sIL-1RⅠ蛋白为菌体内表达。