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脑膜败血金黄杆菌产金属β-内酰胺酶的检测及基因型的研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2006年第8期26卷 734-738页

作者：张嵘周宏伟陈功祥浙江大学医学院附属第二医院检验科杭州310009

目的了解杭州市脑膜败血金黄杆菌的流行及产金属β-内酰胺酶的情况并对其基因型进行研究。方法对100株分离自4所综合性医院的多重耐药脑膜败血金黄杆菌,用三维试验、改良三维试验和2-巯基丙酸抑制试验检测金属β-内酰胺酶,用blaB和GOB... 详细信息

目的了解杭州市脑膜败血金黄杆菌的流行及产金属β-内酰胺酶的情况并对其基因型进行研究。方法对100株分离自4所综合性医院的多重耐药脑膜败血金黄杆菌,用三维试验、改良三维试验和2-巯基丙酸抑制试验检测金属β-内酰胺酶,用blaB和GOB的通用引物对表型试验阳性的菌株进行聚合酶链反应(PCR)和测序分析金属β-内酰胺酶的基因型。并用脉冲场凝胶电泳对其中的菌株进行同源性分析。结果用三维试验、改良三维试验和2-巯基丙酸抑制试验检测到61株菌株产金属β-内酰胺酶,用blaB和GOB通用引物进行扩增和测序,有60株菌株扩增到金属β-内酰胺酶,其中有51株检测到blaB基因型,有36株检测到GOB基因型。检测到的blaB基因型主要为blaB-1、2、3、5和blaB-11这5种类型;检测到的GOB基因型主要为GOB-1、2、4、6和GOB-8这5种类型。其中产生一种金属β-内酰胺酶的有33株,产两种金属β-内酰胺酶的有27株。浙江大学医学院附属第一医院和附属第二医院主要是blaB-3和blaB-11型为主,邵逸夫医院主要是GOB-4和GOB-8为主,杭州市中医院主要是GOB-8基因型。其中1菌株表型试验检测阳性而未能检测到基因型,可能为一种新的基因型,有待以后进一步研究。菌株经同源性分析,杭州市中医院的菌株具有很好的一致性,而与其他医院的结果完全不同。结论杭州市多重耐药的脑膜败血金黄杆菌的耐药机制证实携带的金属β-内酰胺酶基因型主要为blaB和GOB型,4所医院流行的基因型均不相同。而从PFGE结果分析中医院的脑膜败血金黄杆菌具有一定的同源性,有别于其他3所医院,可能为院内感染菌。

关键词：脑膜败血金黄杆菌金属β-内酰胺酶基因型同源性分析

在一株弗劳地柠檬酸杆菌中发现KPC-2型碳青霉烯酶

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中华检验医学杂志 2007年第7期30卷 787-790页

作者：张嵘蔡加昌周宏伟陈功祥浙江大学医学院附属第二医院检验科细菌室杭州310009

柠檬酸杆菌为条件致病菌，机体抵抗力下降时可引起腹泻和肠道外感染如败血症、脑膜炎、泌尿道、呼吸道及创伤感染等。根据中国医院内病原菌耐药监测网（NPRS）数据，1994-2001年分离到的革兰阴性致病菌中，柠檬酸杆菌属占第10位。

关键词：柠檬酸杆菌属碳青霉烯酶弗劳地条件致病菌 2型肠道外感染机体抵抗力创伤感染

β-内酰胺酶合并OmpK36膜孔蛋白缺失引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素敏感性的降低

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中华微生物学和免疫学杂志 2008年第1期28卷 44-49页

作者：张嵘蔡加昌周宏伟陈功祥浙江大学医学院附属第二医院检验科细菌室杭州310009

目的研究肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）对碳青霉烯类抗生素敏感性降低的分子机制。方法临床分离到2株碳青霉烯敏感性降低的Kp Z2554和Z2110，经脉冲场凝胶电泳（PFGE）证实非同一克隆株。对2株细菌进行药物最低抑菌浓度测... 详细信息

目的研究肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）对碳青霉烯类抗生素敏感性降低的分子机制。方法临床分离到2株碳青霉烯敏感性降低的Kp Z2554和Z2110，经脉冲场凝胶电泳（PFGE）证实非同一克隆株。对2株细菌进行药物最低抑菌浓度测定（MIC）、接合试验、质粒图谱分析、等电聚焦电泳（IEF）、特异性PCR扩增和DNA序列分析、外膜蛋白分析以及羰酰氰氯苯腙（CCCP）抑制试验等。结果Kp Z2554和Z2110对亚胺培南和美罗培南的MIC为1～8μg／ml，前者对青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗生素高度耐药，后者对上述抗生素的耐药程度稍弱于前者，但对头孢西丁的MIC大于512μg／ml。IEF、PCR扩增和DNA序列分析证实Kp Z2554产TEM-1（等电点5．4）和CTX-M-14（等电点7．9）2种β-内酰胺酶，Kp Z2110产TEM-1、CTX-M-14和DHA-1（等电点7．8）3种酶。SDS-PAGE分析显示2株细菌均有相对分子质量（Mr）为39×10^3蛋白条带（OmpK36）的缺失。外膜蛋白基因（ompK35和ompK36）序列分析发现，Kp Z2554和Z2110的ompK35基因的个别位点存在点突变，但氨基酸序列不变。CCCP抑制试验显示CCCP不能提高Kp Z2554和Z2110对碳青霉烯类抗生素的敏感性。结论β-内酰胺酶的产生合并OmpK36膜孔蛋白的缺失可引起蜘对碳青霉烯类抗生素敏感性的降低。

关键词：肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药性 β-内酰胺酶膜孔蛋白

头孢西丁纸片法筛查耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的评价

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临床检验杂志 2006年第1期24卷 52-53页

作者：周宏伟张嵘陈功祥浙江大学医学院附属第二医院微生物中心杭州310009

目的评价头孢西丁纸片法筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法。方法采用NCCLS推荐的30μg头孢西丁纸片法和苯唑西林纸片法检测MRSA,以PCR方法检测mecA基因为金标准。同时做头孢西丁对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果用PC... 详细信息

目的评价头孢西丁纸片法筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法。方法采用NCCLS推荐的30μg头孢西丁纸片法和苯唑西林纸片法检测MRSA,以PCR方法检测mecA基因为金标准。同时做头孢西丁对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果用PCR方法检测145株金黄色葡萄球菌,其中mecA基因阳性83株,阴性62株。用头孢西丁纸片法筛查MRSA阳性82株,阴性63株。敏感性为98.8%,特异性为100%。而苯唑西林纸片法检测MRSA敏感性为95.2%,特异性为96.8%。结论头孢西丁纸片法筛查MRSA与mecA基因检测具有很好的一致性,该方法可在常规工作中推广使用。

关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 头孢西丁纸片法筛查

一株耐碳青霉烯类的阴沟肠杆菌的KPC酶检测

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中华医学杂志 2008年第2期88卷 135-138页

作者：蔡加昌周宏伟陈功祥张嵘浙江大学医学院附属第二医院检验科细菌室杭州310009

目的研究阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制。方法临床分离到1株碳青霉烯耐药的阴沟肠杆菌ZY1465。对该菌株进行药物最低抑菌浓度（MIC）测定、接合试验、质粒图谱分析、等电聚焦电泳、特异性PCR扩增和DNA序列分析以及外膜蛋白分... 详细信息

目的研究阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制。方法临床分离到1株碳青霉烯耐药的阴沟肠杆菌ZY1465。对该菌株进行药物最低抑菌浓度（MIC）测定、接合试验、质粒图谱分析、等电聚焦电泳、特异性PCR扩增和DNA序列分析以及外膜蛋白分析等。结果阴沟肠杆菌ZY1465对亚胺培南和美罗培南的MIC均为32μg／ml，对青霉素类、头孢菌素类、头孢西丁、氨曲南、喹诺酮类和氨基糖苷类等多种抗生素呈高水平耐药。接合试验使受体菌大肠埃希菌对亚胺培南和美罗培南的敏感性明显降低（MIC由接合前的≤0．125μg／ml变为接合后的2μg／ml）。质粒酶切图谱分析表明转移接合子的质粒与编码blaKPC-2基因的质粒完全相同。等电聚焦显示阴沟肠杆菌ZY1465产等电点（pI）分别为5．4、6．7、7．3、7．8、7．9和8．6共6种β-内酰胺酶，转移接合子只产等电点6．7的1种β-内酰胺酶。特异性PCR扩增和测序证实该菌中存在TEM-1、肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶2（KPC-2）、DHA-1、CTX—M-14、CTX—M-3和染色体AmpC（等电聚焦电泳中未检测到）等耐药基因。外膜蛋白的尿素-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示阴沟肠杆菌ZY1465有38000蛋白条带的缺失。结论首次在国内分离到产KPC-2型碳青霉烯酶的阴沟肠杆菌，多种β-内酰胺酶尤其是KPC-2的产生合并外膜蛋白缺失引起阴沟肠杆菌ZY1465对碳青霉烯类抗生素耐药。

关键词：肠杆菌,阴沟青霉素抗药性碳青霉烯 KPC-2 外膜蛋白

对亚胺培南耐药粘质沙雷菌中质粒介导KPC-2型碳青霉烯酶的研究分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第8期27卷 734-738页

作者：张嵘蔡加昌周宏伟陈功祥浙江大学医学院附属第二医院临床检验中心杭州310009

目的研究粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的分子机制。方法临床分离到1株亚胺培南耐药的粘质沙雷菌[最小抑菌浓度(MIC)为64μg/ml]。将粘质沙雷菌和大肠杆菌进行接合试验,采用琼脂稀释法检测粘质沙雷菌和接合前后大肠杆菌对药物的MIC;提取粘... 详细信息

目的研究粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的分子机制。方法临床分离到1株亚胺培南耐药的粘质沙雷菌[最小抑菌浓度(MIC)为64μg/ml]。将粘质沙雷菌和大肠杆菌进行接合试验,采用琼脂稀释法检测粘质沙雷菌和接合前后大肠杆菌对药物的MIC;提取粘质沙雷菌和接合后大肠杆菌的酶粗提液进行等电聚焦电泳和三维试验;特异性PCR扩增和DNA序列分析确认引起粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的β-内酰胺酶的基因型。结果除碳青霉烯类抗生素外,粘质沙雷菌还对青霉素类、头孢菌素类和单酰胺类等抗生素耐药,对喹诺酮类和氨基糖甙类抗生素敏感;接合试验可使大肠杆菌获得与粘质沙雷菌相似的耐药谱;等电聚焦电泳显示粘质沙雷菌中存在等电点(PI)分别为6.5和6.7的两种β-内酰胺酶,接合后的大肠杆菌存在PI为6.7的β-内酰胺酶;特异性PCR扩增和DNA序列分析证实PI为6.7的β-内酰胺酶为碳青霉烯酶KPC-2,其核苷酸及氨基酸序列已递交到GenBank,PI为6.5的酶有待进一步研究;在一维试验中,克拉维酸、乙二胺四乙酸(EDTA)和氯唑西林均不能抑制KPC-2酶对业胺培南的水解活性。结论首次在粘质沙雷菌中发现碳青霉烯酶KPC-2,该酶是引起粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的主要原因。

关键词：粘质沙雷菌耐药性碳青霉烯酶 KPC-2

中性粒细胞杀菌活性试验检测高毒力肺炎克雷伯菌毒力的研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2017年第11期37卷 856-861页

作者：舒玲斌孙巧玲胡洁张嵘陈功祥浙江大学医学院附属第二医院检验科杭州310009

目的利用中性粒细胞杀菌活性试验,检测毒力基因rmpA、rmpA2阳性和拉丝试验阳性的高毒力肺炎克雷伯菌抗中性粒细胞杀菌能力,验证该试验鉴定高毒力肺炎克雷伯菌的可行性.方法收集浙江省2016年1月至2017年7月期间临床血流感染分离的150... 详细信息

目的利用中性粒细胞杀菌活性试验,检测毒力基因rmpA、rmpA2阳性和拉丝试验阳性的高毒力肺炎克雷伯菌抗中性粒细胞杀菌能力,验证该试验鉴定高毒力肺炎克雷伯菌的可行性.方法收集浙江省2016年1月至2017年7月期间临床血流感染分离的150株非重复肺炎克雷伯菌.采用PCR检测碳青霉烯类抗生素耐药基因（blaKPC,blaNDM,blaIMP-1,blaIMP-2）、荚膜血清型（K1,K2,K5,K20,K54,K57）和毒力基因（rmpA,rmpA2,iucA,iroN）.将拉丝试验阳性和毒力基因rmpA、rmpA2阳性的菌株定义为高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）,拉丝试验和毒力基因rmpA、rmpA2阴性的菌株定义为经典肺炎克雷伯菌（cKP）.采用中性粒细胞杀菌活性试验检测肺炎克雷伯菌的毒力,细菌的存活率计算方式为：加中性粒细胞共孵育的实验组菌落形成单位（CFU）/不加中性粒细胞共孵育的对照组CFU.结果 150株肺炎克雷伯菌中检测到65株携带rmpA2毒力基因,占43.3％.在rmpA2阳性菌株中,rmpA、iroN、blaKPC和K2的检出率分别为73.8％、80.0％、75.4％和40.0％,拉丝试验阳性率为36.9％;中性粒细胞杀菌试验中,hvKP组菌株和cKP组菌株的存活率分别为0.866±0.056和0.368±0.058,两组存活率差异有统计学意义（P〈0.001）.结论分离自浙江省携带rmpA、rmpA2毒力基因和拉丝试验阳性的hvKP经中性粒细胞处理后仍有非常高的存活率,中性粒细胞杀菌活性试验阳性,该试验是一个鉴定肺炎克雷伯菌毒力简单有效的方法.

关键词：高毒力肺炎克雷伯菌 rmpA2 拉丝试验中性粒细胞杀菌活性

水环境分离细菌及临床分离弗劳地柠檬酸杆菌中喹诺酮耐药基因qnr及aac（6’）-Ib-cr的检测

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中华微生物学和免疫学杂志 2010年第4期30卷 371-376页

作者：张嵘蔡加昌周宏伟陈功祥浙江大学医学院附属第二医院检验科细菌室杭州310009

目的调查水环境分离细菌及临床分离弗劳地柠檬酸杆菌中喹诺酮耐药基因qnr和aac（6’）-Ib-cr的流行情况及qnr基因型分布。方法从杭州10个不同的水域中分离细菌，从4个城市的多家医院收集弗劳地柠檬酸杆菌临床菌株。琼脂稀释法测定环丙... 详细信息

目的调查水环境分离细菌及临床分离弗劳地柠檬酸杆菌中喹诺酮耐药基因qnr和aac（6’）-Ib-cr的流行情况及qnr基因型分布。方法从杭州10个不同的水域中分离细菌，从4个城市的多家医院收集弗劳地柠檬酸杆菌临床菌株。琼脂稀释法测定环丙沙星、左氧氟沙星和萘啶酸对细菌的最低抑菌浓度（MIC）。PCR方法检测细菌中qnrA、qnrB、qnrS及aac（6’）-Ib-cr基因。对PCR产物进行测序及序列分析，确定各基因型别。结果从水环境分离到78株革兰阴性杆菌（包括33株肠杆菌科细菌、21株气单胞菌属、10株不动杆菌属、10株假单胞菌属、2株产碱杆菌属和2株邻单胞菌属细菌）。10株弗劳地柠檬酸杆菌中有8株qnrB基因阳性；9株大肠埃希菌中qnrS1和aac（6’）-Ib-cr基因阳性各1株；1株斑点气单胞菌（Aeromonaspunctata）qnrS2阳性。临床分离的103株弗劳地柠檬酸杆菌中，qnr基因检出75株（72．8％），其中qnrA1有3株（2．9％），qnrB有65株（63．1％），qnrS2有1株（1．0％），qnrA1合并qnrB阳性5株（4．8％），qnrS1合并qnrB阳性1株；aac（6’）-Ib检出33株（32．0％），其中12株（11．6％）存在-cr变异体。qnrB的基因型以qnrB9、qnrB8和qnrB6为主。结论首次在欧洲以外地区分离到携带qnrS2基因的气单胞菌属细菌。水环境及临床分离的弗劳地柠檬酸杆菌中qnrB基因的携带率非常高，后者同时有较高的aac（6’）-Ib-cr携带率。弗劳地柠檬酸杆菌中qnrB基因的亚型以qnrB9、qnrB8和qnrB6最为常见。

关键词：环境细菌喹诺酮耐药性 qnr aac(6’)-I b-cr

gyrB基因和16S rRNA基因序列分析在沙门菌属细菌鉴别中的临床应用评价

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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第4期27卷 368-369页

作者：张嵘蔡加昌张书梅周宏伟陈功祥浙江大学医学院附属第二医院临床检验中心杭州310009

最近研究发现，gyrB基因是16S rRNA基因以外适合细菌鉴别的又一理想靶基因。gyrB基因是编码DNA解旋酶B亚单位的基因，其显著优点是基因进化率较快，碱基替换频率较高，在相似细菌的检测和鉴别方面比16S rRNA基因更具优越性。本实验以10... 详细信息

最近研究发现，gyrB基因是16S rRNA基因以外适合细菌鉴别的又一理想靶基因。gyrB基因是编码DNA解旋酶B亚单位的基因，其显著优点是基因进化率较快，碱基替换频率较高，在相似细菌的检测和鉴别方面比16S rRNA基因更具优越性。本实验以10株沙门菌为受试对象，

关键词： rRNA基因 rB基因细菌鉴别沙门菌属 16S 临床应用评价基因序列分析 DNA解旋酶