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细胞可透过性Cre重组酶表达、纯化及生物活性检测(英文)

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生物化学与生物物理进展 2004年第9期31卷 784-790页

作者：郭中敏徐康岳颖黄冰唐欢马芸洪迅陈系古肖东中山大学实验动物中心广州510080 中山大学第一附属医院广州510080 第三军医大学重庆400010

Cre/loxP系统由Cre位点特异重组酶和可被Cre特异性识别的loxP位点构成,该系统广泛用于条件性基因敲除和表达,以研究基因功能.为了表达和纯化一种细胞可透过性Cre重组酶(即His6 NLS Cre MTS);经IPTG诱导,在BL2 1(DE3)宿主菌成功表达His6... 详细信息

Cre/loxP系统由Cre位点特异重组酶和可被Cre特异性识别的loxP位点构成,该系统广泛用于条件性基因敲除和表达,以研究基因功能.为了表达和纯化一种细胞可透过性Cre重组酶(即His6 NLS Cre MTS);经IPTG诱导,在BL2 1(DE3)宿主菌成功表达His6 NLS Cre MTS融合蛋白,通过His BondNi NTA树脂分离并纯化了该蛋白质,随后借助细胞和非细胞的重组系统成功检测了His6 NLS Cre MTS的生物活性.

关键词： Cre/lox P系统细胞可透过性Cre重组酶表达纯化生物活性检测细胞和非细胞的重组系统

携带EGFP基因的逆转录病毒载体的构建及初步应用

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中山大学学报（医学科学版） 2009年第2期30卷 154-159页

作者：赵宁郭中敏陈系古中山大学实验动物中心广东广州510080

【目的】构建携带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的逆转录病毒载体,观察GFP的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。【方法】以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应,获得完整保留pEGFP-C1载体多克隆酶切位点(MCS)的EGFP基因片段,定向插入逆... 详细信息

【目的】构建携带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的逆转录病毒载体,观察GFP的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。【方法】以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应,获得完整保留pEGFP-C1载体多克隆酶切位点(MCS)的EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后获得具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪(FACS)观察EGFP做为报告基因在体外的表达情况、以及对靶细胞生物特性的影响。【结果】成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并稳定表达,对靶细胞的生长无抑制。高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98%的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30%细胞表达GFP。【结论】使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低,所构建的pLXSN-EGFP载体可在体外稳定表达,为再插入治疗用基因进行后续研究奠定基础。

关键词： EGFP基因逆转录病毒载体 pLXSN-EGFP 转染 SW038-C2细胞

丙型肝炎病毒核心蛋白基因表达致人肝细胞恶性转化的研究

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生物化学与生物物理进展 2004年第3期31卷 213-218页

作者：单于陈系古黄冰胡安斌郭中敏黄文革中山大学实验动物中心广州510080 华中科技大学同济医学院附属协和医院肝胆外科武汉430022

丙型肝炎病毒核心 (HCV C)蛋白是维持丙型肝炎病毒结构的重要蛋白质 ,由于参与调节细胞的生长与凋亡 ,被认为与HCV感染所致的肝硬化及肝细胞癌的发生有关 .为了进一步探索HCV C蛋白与肝细胞癌发生的关系 ,首先构建了表达HCV C蛋白的真... 详细信息

丙型肝炎病毒核心 (HCV C)蛋白是维持丙型肝炎病毒结构的重要蛋白质 ,由于参与调节细胞的生长与凋亡 ,被认为与HCV感染所致的肝硬化及肝细胞癌的发生有关 .为了进一步探索HCV C蛋白与肝细胞癌发生的关系 ,首先构建了表达HCV C蛋白的真核表达载体 ,脂质体介导转染Chang liver人肝细胞株 ,建立表达HCV C蛋白的人肝细胞模型 ,RT PCR方法检测HCV C基因在人肝细胞内的表达 ,蛋白质印迹和免疫细胞化学方法鉴定Chang liver肝细胞内HCV C蛋白及其在细胞内的分布情况 .表达HCV C蛋白的Chang liver人肝细胞培养 2 0代以后 ,与对照组细胞相比 ,细胞的形态出现长梭形样改变 ,生长速度显著加快 ,细胞内DNA含量的均一性变差 .接种表达HCV C蛋白的Chang liver人肝细胞的 6只裸鼠在第 2 0天时全部有肿瘤长出 ,且肿瘤组织结构符合肝细胞癌病理形态特点 ,对照组裸鼠未见肿瘤生长 .上述结果表明HCV C基因表达可导致Chang liver人肝细胞发生恶性转化 ,提示HCV C蛋白与HCV感染所致肝细胞癌的发生有直接关系 .

关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白基因表达人肝细胞 HCV-C蛋白恶性转化肝细胞癌 Chang-liver

定向诱导小鼠ES细胞为肝脏细胞及其凝血因子Ⅷ,Ⅸ的表达

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中国科学（C辑） 2005年第3期35卷 269-274页

作者：孟瑛黄绍良闵军郭中敏中山大学第二附属医院干细胞研究中心广州510120 中山大学中山医学院实验动物中心广州510089

凝血因子Ⅷ,Ⅸ缺陷导致血友病A和B的发生,肝细胞是产生凝血因子的器官,利用肝细胞进行替代治疗是纠正凝血因子缺陷的根本办法,但是其来源及利用存在难以克服的问题.ES细胞具有体外培养时保持未分化状态和无限的增殖能力,具有在一定条件... 详细信息

凝血因子Ⅷ,Ⅸ缺陷导致血友病A和B的发生,肝细胞是产生凝血因子的器官,利用肝细胞进行替代治疗是纠正凝血因子缺陷的根本办法,但是其来源及利用存在难以克服的问题.ES细胞具有体外培养时保持未分化状态和无限的增殖能力,具有在一定条件下可以分化发育成各个胚层细胞的潜能,利用ES细胞源性肝细胞作为供体细胞,解决了肝细胞来源困难、增殖能力差的难题.体外分阶段定向诱导E14小鼠ES细胞分化为肝细胞,ICG摄取及PAS反应结果证实ES源性细胞具备肝细胞功能,在此基础上,利用RT-PCR法对诱导细胞初步进行了凝血因子Ⅷ,Ⅸ表达分析,为进一步开展利用ES细胞纠正凝血因子缺乏奠定了研究基础.

关键词：凝血因子Ⅷ ES细胞定向诱导肝脏细胞小鼠 RT-PCR法增殖能力 PAS反应肝细胞替代治疗体外培养供体细胞细胞来源细胞分化细胞功能表达分析血友病分阶段性细胞缺陷纠正基础胚层

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人工合成抗菌肽的常用方法及应用前景

中国抗生素杂志 2012年第3期37卷 176-183页

作者：彭博郭中敏陆家海中山大学公共卫生学院热带病防治研究教育部重点实验室广东省重大传染病预防和控制技术研究中心广州510080 中山大学实验动物中心广州510080

抗菌肽是来自生物体内经诱导产生的一种具有抗菌活性的小分子多肽,能够高效杀灭多种革兰阴性、阳性菌,其作为抗生素的替代品,能有效解决耐药性等问题。由于天然产生的抗菌肽数量较少,往往很难大量获得,而通过人工合成方法,可解决表达量... 详细信息

抗菌肽是来自生物体内经诱导产生的一种具有抗菌活性的小分子多肽,能够高效杀灭多种革兰阴性、阳性菌,其作为抗生素的替代品,能有效解决耐药性等问题。由于天然产生的抗菌肽数量较少,往往很难大量获得,而通过人工合成方法,可解决表达量和所需成本等问题,也可在一定程度上进行抗菌肽抑菌功能上的改进。本文综述了人工合成抗菌肽的常用方法与研究进展,探讨了人工合成抗菌肽在未来的应用前景。

关键词：抗菌肽化学合成人工合成基因工程表达体系 NDM-1

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胚胎干细胞研究临床应用性的挑战(英文)

中国组织工程研究与临床康复 2008年第47期12卷 9378-9383页

作者：徐绍坤胡海勋郭中敏中山大学实验动物中心广东省广州市510080

胚胎干细胞是存在于胚胎发育早期阶段,具有自我更新和多分化潜能的干细胞,是组成机体各种组织器官的起源细胞。在一定条件下,其在体外可以保持未分化状态,长期存活无限繁殖。有关胚胎干细胞在动物疾病模型中治疗作用的研究,尤其是在小... 详细信息

胚胎干细胞是存在于胚胎发育早期阶段,具有自我更新和多分化潜能的干细胞,是组成机体各种组织器官的起源细胞。在一定条件下,其在体外可以保持未分化状态,长期存活无限繁殖。有关胚胎干细胞在动物疾病模型中治疗作用的研究,尤其是在小鼠胚胎干细胞的研究,已趋于成熟。在此基础上,人们开始尝试将人类胚胎干细胞用于临床治疗各种疾病,探讨其可行性和安全性等问题。目前胚胎干细胞已经应用在治疗糖尿病、帕金森及心血管损伤等各种疾病中,虽然有很多技术问题和社会伦理问题需要解决与克服,相信随着胚胎干细胞定向分化机制的逐渐完善,优化培养体系的建立,致瘤性的解决,该细胞疗法作为一种新的治疗方式,将适用于临床使用。

关键词：胚胎干细胞干细胞治疗致瘤性

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体外定向诱导E14小鼠胚胎干细胞为肝细胞

中华肝脏病杂志 2004年第12期12卷 714-717页

作者：孟瑛黄绍良闵军郭中敏吴燕峰包蓉广州中山大学附属第二医院干细胞研究中心 510120 广州中山大学中山医学院实验动物中心

目的探索体外定向诱导胚胎干细胞分化为肝细胞。方法常规方法培养E14小鼠胚胎干细胞(ESC)后,进行悬滴(?)悬浮培养,形成胚胎体,再进行分阶段定向诱导,在培养第9-12天、第12-18天以及第15-18天分别加入酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞... 详细信息

目的探索体外定向诱导胚胎干细胞分化为肝细胞。方法常规方法培养E14小鼠胚胎干细胞(ESC)后,进行悬滴(?)悬浮培养,形成胚胎体,再进行分阶段定向诱导,在培养第9-12天、第12-18天以及第15-18天分别加入酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和制瘤素M。利用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分析特异性基因mRNA的表达,并用吲哚氰绿(ICG)摄取和过碘酸雪夫反应(PAS)分析细胞的分化及功能。结果在诱导培养的第13天,细胞出现肝细胞样改变。RT-PCR分析可见,在诱导的第6天和第12天分别可以检测到内胚层或卯黄囊分化标志基因--甲状腺素运载蛋白和α1抗胰蛋白酶的mRNA表达,第6天出现未成熟肝细胞标志基因--甲胎蛋白mRNA表达,第9天,第15天和第18天分别开始出现成熟肝细胞的特异性标志基因--白蛋白、葡萄糖6磷酸酶、酪氨酸氨基转移酶mRNA表达。同时,ESC源性肝细胞表现为ICG摄取和PAS反应阳性,经过诱导,ICG阳性细胞数约占85.1％。结论 ESC源性肝细胞具备肝细胞特性,ESC有可能成为肝细胞治疗的替代供体细胞。

关键词：成熟肝细胞 mRNA表达干细胞 ESC 体外定向诱导基因摄取小鼠胚胎悬浮培养分化

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在肺腺癌细胞的表达

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中华结核和呼吸杂志 2002年第11期25卷 696-697页

作者：陈建波罗一鲁郭中敏陈系古广州市胸科医院检验科 510095 中山大学实验动物中心

肺癌是目前最常见和最难治的肿瘤之一,发病率和病死率都很高,易发生转移.肺癌治疗目前主要依靠传统的手术、放射治疗和化学治疗,其疗效较差.随着分子生物学技术的发展,基因治疗肿瘤成为可能.""自杀基因""的出现因其能彻底杀伤肿瘤细胞,... 详细信息

肺癌是目前最常见和最难治的肿瘤之一,发病率和病死率都很高,易发生转移.肺癌治疗目前主要依靠传统的手术、放射治疗和化学治疗,其疗效较差.随着分子生物学技术的发展,基因治疗肿瘤成为可能.""自杀基因""的出现因其能彻底杀伤肿瘤细胞,因而受到广泛重视,被认为是最有希望成为临床肿瘤治疗的有效方法.

关键词：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因肺腺癌基因治疗

表达丙肝病毒核心蛋白基因的人肝细胞模型的建立

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中华实验外科杂志 2003年第11期20卷 1043-1045页

作者：单于陈系古黄冰胡安斌郭中敏赵宁中山大学实验动物中心广州510080 华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科

目的　构建表达丙型肝炎病毒核心蛋白 (HCV C)基因的人肝细胞模型。方法　用聚合酶链反应 (PCR)方法从 pHCV MA质粒中钩出HCV C基因 ,酶切纯化后克隆于质粒 pTRE中 ,建立重组质粒 pTRE C。pTRE C经酶切、纯化后目的片段与质粒PcDNA3连... 详细信息

目的　构建表达丙型肝炎病毒核心蛋白 (HCV C)基因的人肝细胞模型。方法　用聚合酶链反应 (PCR)方法从 pHCV MA质粒中钩出HCV C基因 ,酶切纯化后克隆于质粒 pTRE中 ,建立重组质粒 pTRE C。pTRE C经酶切、纯化后目的片段与质粒PcDNA3连接 ,通过限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒PcDNA3 tRe C ,由脂质体介导转染Chang liver人肝细胞 ,建立表达HCV C基因的人肝细胞模型 ,PCR方法鉴定Chang liver人肝细胞内HCV C基因 ,反转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法检测HCV C基因在Chang liver人肝细胞内的表达 ,抗生物素蛋白生物素过氧化物酶复合体法 (ABC法 )方法分析HCV核心蛋白在人肝细胞内的表达及定位。结果　构建了表达HCV C基因的重组真核表达载体 ,并在Chang liver人肝细胞中表达出HCV C蛋白。结论　成功地建立了表达HCV C基因的人肝细胞模型 ,该模型为进一步研究HCV C的生物学特性及HCV感染所致肝硬化、肝癌的致病机制提供基础材料。

关键词：人肝细胞模型丙型肝炎病毒核心蛋白基因聚合酶链反应丙型肝炎病毒感染 C蛋白