携带EGFP基因的逆转录病毒载体的构建及初步应用

作     者：赵宁 郭中敏 陈系古 

作者机构：中山大学实验动物中心广东广州510080 

出 版 物：《中山大学学报（医学科学版）》 (Journal of Sun Yat-Sen University:Medical Sciences)

年 卷 期：2009年第30卷第2期

页      面：154-159页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

基　　金：广东省重点攻关课题(522203045) 广东省博士启动基金(984058) 

主　　题：EGFP基因 逆转录病毒载体 pLXSN-EGFP 转染 SW038-C2细胞 

摘      要：【目的】构建携带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的逆转录病毒载体,观察GFP的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。【方法】以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应,获得完整保留pEGFP-C1载体多克隆酶切位点(MCS)的EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后获得具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪(FACS)观察EGFP做为报告基因在体外的表达情况、以及对靶细胞生物特性的影响。【结果】成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并稳定表达,对靶细胞的生长无抑制。高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98%的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30%细胞表达GFP。【结论】使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低,所构建的pLXSN-EGFP载体可在体外稳定表达,为再插入治疗用基因进行后续研究奠定基础。