羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用
会议名称：《中国微生物学会兽医微生物学专业委员会暨中国畜牧兽医学会生物制品学分会2021年学术论坛》
会议日期：2021年
学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学]
摘 要：羊痘（Capripox）是由羊痘病毒（Capripoxvirus）引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病,被世界动物卫生组织列为必须报告的动物疫病。羊痘病毒为痘病毒科（Poxviridae）羊痘病毒属（Capripoxvirus）成员,包括绵羊痘病毒（Sheeppoxvirus）、山羊痘病毒（Goatpoxvirus）和牛结节性皮肤病病毒（Lump skin disease virus）。山羊和绵羊都易感染此病毒,羔羊感染后能够引起较高的死亡率,妊娠母羊甚至引起流产。该病对畜牧养殖业和国际贸易产生严重的影响。本研究建立一种方便快捷的荧光定量PCR检测方法,对该病毒进行高效、准确的鉴别诊断。共分为以下四部分:1.选择羊痘病毒保守区的ORF74号基因作为目的基因。利用Beacon designer 8设计多条引物和探针,经过Blast和分析,扩增片段为92bp。在探针的5’端用RED标记,3’端用MGB标记。2.提取山羊痘病毒疫苗株AV41株的核酸,用设计的上下游引物进行目的片段的扩增,之后将其连接于pTopo-Blunt载体,用DH5α进行转化,建立质粒标准品。3.利用正交法优化引物和探针的浓度,选取Ct值较低和荧光信号强度较高所对应的的引物和探针浓度为最佳反应体系。4.建立荧光定量标准曲线,分析扩增效率,并对其敏感性,特异性和重复性进行测定。结果表明,标准曲线斜率-3.436,相关系数R为0.9999,扩增效率达到95.45%。将质粒进行10倍系列连续稀释经检测该方法能检出最低拷贝数为9拷贝数/1,以蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒、布氏杆菌、羊口疮病毒、羊腐败梭菌的核酸为模板进行特异性检测,仅有羊痘病毒有扩增曲线,表明该方法特异性良好。检测其组间重复性和组内重复性的变异系数均小于2%,表明该方法重复性良好。最后采集发病羊的病料,提取DNA进行检测,均能检出病毒核酸,阴性对照未检出。表明所建立的基于ORF74基因建立的实时荧光定量PCR检测方法适用于羊痘病毒的快速检测。