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犬弓形虫巢式PCR检测方法的建立及初步应用

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中国动物传染病学报 2024年第1期32卷 129-134页

作者：柳方远李双星印春生吉婧朱明哲刘业兵中国兽医药品监察所北京100081 张家港市畜牧兽医站张家港215600 青岛农业大学青岛266109

弓形虫病是一种重要的人兽共患病,犬是弓形虫重要的中间宿主,有必要建立一种快速、灵敏的犬弓形虫病检测方法。根据GenBank中弓形虫529 bp基因重复序列设计巢式PCR引物,通过优化反应条件建立巢式PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方... 详细信息

弓形虫病是一种重要的人兽共患病,犬是弓形虫重要的中间宿主,有必要建立一种快速、灵敏的犬弓形虫病检测方法。根据GenBank中弓形虫529 bp基因重复序列设计巢式PCR引物,通过优化反应条件建立巢式PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬新孢子虫的基因扩增无条带;灵敏度试验结果显示,该方法最低可以检出0.134 pg的弓形虫基因,比目前国标PCR方法高100倍。对感染弓形虫犬的组织样品检测发现,巢式PCR能在感染犬的不同组织中检测出弓形虫基因。建立的犬弓形虫巢式PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为该病的检测奠定了基础。

关键词：弓形虫巢式PCR 犬

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重组犬IFN-α的原核表达及抗病毒活性研究

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中国兽医科学 2024年第5期54卷 632-640页

作者：李乐琴曹众达李海珠杜吉革朱真陈小云罗玉峰胡仕凤印春生湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128 中国兽医药品监察所北京102629

本试验旨在建立犬α干扰素(CaIFN-α)原核表达及纯化方法,并对其抗病毒活性进行研究。通过构建pET-28a/CaIFN-α表达载体,高效表达和纯化rCaIFN-α;采用CCK-8法在犬肾细胞(MDCK)上测定rCaIFN-α的细胞毒性,在MDCK/VSV系统中测定其抗病... 详细信息

本试验旨在建立犬α干扰素(CaIFN-α)原核表达及纯化方法,并对其抗病毒活性进行研究。通过构建pET-28a/CaIFN-α表达载体,高效表达和纯化rCaIFN-α;采用CCK-8法在犬肾细胞(MDCK)上测定rCaIFN-α的细胞毒性,在MDCK/VSV系统中测定其抗病毒活性效价;RT-qPCR检测rCaIFN-α作用MDCK细胞后下游ISGs的表达水平;进一步利用TCID 50和间接免疫荧光(IFA)测定rCaIFN-α抗犬副流感病毒(CPIV)和犬瘟热病毒(CDV)的感染能力。电泳和Western-blot结果显示,成功制备原核表达的特异性rCaIFN-α;CCK-8结果显示重组蛋白无明显细胞毒性,细胞病变抑制法测定抗VSV病毒活性效价为1.39×107 U/mL;RT-qPCR显示rCaIFN-α可显著上调ISG15、Mxl等ISGs的转录水平;IFA等结果显示,rCaIFN-α对CPIV和CDV具有良好的抗病毒作用。结果表明,本试验制备的rCaIFN-α具有优良的抗病毒感染活性,为进一步研发新型宠物抗病毒制剂奠定了基础。

关键词：犬IFN-α 原核表达干扰素刺激基因(ISGs) 抗病毒活性

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犬细小病毒样颗粒的制备及免疫原性分析

中国兽医科学 2024年第1期54卷 19-25页

作者：王傲陈欢苗雨润赵普李家俊郑龙三戴建君印春生钱莺娟南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室江苏省外国专家工作室江苏南京210095 中国兽医药品监察所北京100081

犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)引起犬的一种急性、高度传染性和致死性的病毒性疾病。该病主要通过接种疫苗预防,没有特效治疗方法。为了制备犬细小病毒样颗粒(virus like particles,VLPs),本研究通过杆状病毒表达... 详细信息

犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)引起犬的一种急性、高度传染性和致死性的病毒性疾病。该病主要通过接种疫苗预防,没有特效治疗方法。为了制备犬细小病毒样颗粒(virus like particles,VLPs),本研究通过杆状病毒表达系统表达CPV VP2蛋白。将表达后的蛋白经过蔗糖密度梯度离心法纯化后,负染色处理置于透射电子显微镜下观察。结果显示VP2蛋白组装成直径25 nm左右的六边形或圆形样VLPs。血凝试验表明,该VLPs可以凝集猪红细胞,血凝价为27。进一步将该VLPs经弗氏佐剂乳化后免疫小鼠,血凝抑制试验结果显示VLPs可诱导小鼠产生211的血凝抑制抗体。因此,通过杆状病毒表达系统表达VP2蛋白,VP2蛋白可在细胞内组装成与病毒粒子类似的VLPs,该VLPs可以诱导小鼠产生血凝抑制抗体,为CPV VLPs疫苗的制备奠定了基础。

关键词：犬细小病毒 VP2蛋白杆状病毒病毒样颗粒

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犬细小病毒病防控技术研究进展

中国兽药杂志 2024年第6期58卷 86-94页

作者：王诗研印春生曹众达张石豪张嘉雯中国兽医药品监察所(农业农村部兽药评审中心) 北京100081 山西农业大学山西太谷030801 中国农业科学院特产研究所长春130112

犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)感染会导致典型的急性胃肠炎,出现呕吐、发热、白细胞显著减少和出血性腹泻等症状,常与犬瘟热病毒、犬冠状病毒等其他病毒混合感染。尽管进行了广泛的疫苗接种,但CPV仍然是导致犬死亡的主要原因,幼犬... 详细信息

犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)感染会导致典型的急性胃肠炎,出现呕吐、发热、白细胞显著减少和出血性腹泻等症状,常与犬瘟热病毒、犬冠状病毒等其他病毒混合感染。尽管进行了广泛的疫苗接种,但CPV仍然是导致犬死亡的主要原因,幼犬死亡率常大于70%。通过对比不同类型CPV疫苗的不同特点及实际使用情况,同时分析免疫失败的原因,介绍目前诊断犬细小病毒病的主要方法及近年来取得的技术进步,对犬细小病毒病防控技术研究进展进行了综述,为犬细小病毒病的免疫、诊断及防控提供参考。

关键词：犬细小病毒防控诊断疫苗

禽多瘤病毒VP4蛋白单克隆抗体的制备及其间接免疫荧光检测方法的初步建立

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中国兽医科学 2024年第5期54卷 584-594页

作者：汪溪翟天舒许冠龙王嘉孔冬妮邓永闫佳佳薛青红印春生何后军陈小云毛娅卿江西农业大学动物科学技术学院江西南昌330045 中国兽医药品监察所北京100081 山西农业大学动物医学学院山西太谷030801

为制备禽多瘤病毒(avian polyomavirus,APV)VP4蛋白单克隆抗体,初步建立APV的间接免疫荧光检测方法,本研究通过原核表达APV VP4蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,以制备的VP4单克隆抗体为一抗,FITC-山羊抗小鼠IgG为二抗,优化反... 详细信息

为制备禽多瘤病毒(avian polyomavirus,APV)VP4蛋白单克隆抗体,初步建立APV的间接免疫荧光检测方法,本研究通过原核表达APV VP4蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,以制备的VP4单克隆抗体为一抗,FITC-山羊抗小鼠IgG为二抗,优化反应条件。结果表明,筛选获得15株阳性细胞株,经亚型鉴定,其中2株单克隆抗体的重链为IgG2b类型,13株重链为IgG1类型,轻链均为κ型。选择3株细胞制备单克隆抗体,这3株抗VP4单克隆抗体浓度分别为2.9、2.6、3.2 mg/mL;亲和常数分别为1.06×10^(10)、2.95×10^(9)、9.60×10^(9)。其中两株效价均为1∶204800,另一株的效价为1∶51200。经Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,这3株单克隆抗体均能与APV发生特异性反应;本研究建立的间接免疫荧光检测方法的最适条件为:Anti-A-VP4-151∶1000倍稀释,4℃条件下过夜孵育,二抗1∶200稀释,37℃条件下孵育1 h。以建立的方法检测细胞中的减蛋综合征病毒(EDSV)、网状内皮组织增生症病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)和APV,只有APV的检测结果显示阳性,检测其他病毒的结果均为阴性。应用该单克隆抗体建立的间接免疫荧光方法在细胞上能检出至少5 TCID50 APV感染。本研究制备的单克隆抗体和建立的间接免疫荧光方法为APV感染的流行病学调查和实验室诊断奠定了基础。

关键词：禽多瘤病毒 VP4蛋白原核表达单克隆抗体间接免疫荧光试验

基于FIPV S蛋白单抗的竞争ELISA方法建立及应用

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中国兽药杂志 2024年第9期58卷 7-14页

作者：刘妍杜吉革朱真王诗研张石豪王团结焦文杰印春生孙卫东中国兽医药品监察所(农业农村部兽药评审中心) 北京100081 南京农业大学南京210095

为给猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的流行和地理分布提供有价值的检测手段,以FIPV S蛋白为包被抗原,利用FIPV的特异性单克隆抗体(FIPV MAb 3D8)为竞争抗体,经条件优化,建立一种快速检测FIPV抗体的竞争ELISA法。优化结果表明最佳条件为:包被... 详细信息

为给猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的流行和地理分布提供有价值的检测手段,以FIPV S蛋白为包被抗原,利用FIPV的特异性单克隆抗体(FIPV MAb 3D8)为竞争抗体,经条件优化,建立一种快速检测FIPV抗体的竞争ELISA法。优化结果表明最佳条件为:包被抗原质量浓度10μg/mL,血清稀释度1∶4;FIPV MAb 3D8稀释倍数1∶100,酶标二抗稀释倍数1∶5000;CBS在37℃包被1 h,5%BSA在37℃封闭2 h,FIPV MAb 3D8在37℃孵育1 h,TMD底物显色液37℃避光5 min。临界值PI≥25.76%时为阳性,PI<20.22%为阴性。该方法特异性较强,重复性较好。利用该方法和已发表的其他方法同时对来自宠物医院的62份临床血清样本进行检测,总体符合率为85.5%,表明该方法准确性较高。本研究建立了快速准确测定FIPV抗体的竞争ELISA方法,适用于临床样本检测,为猫传染性腹膜炎的鉴定、防控和流行病学调查提供支持。

关键词：猫传染性腹膜炎病毒竞争ELISA 单克隆抗体

镧系金属离子Ln^(3+)定量构效关系的神经网络研究

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高等学校化学学报 2001年第9期22卷 1466-1471页

作者：杨兴华印春生潘忠孝湖南省怀化师范专科学校化学系怀化418008 中国科学技术大学应用化学系合肥230026

以 Ln3+ 离子的半径、电负性、 4 f电子排布周期因子 q(本文自定义 )以及基态 L值等为参数 ,使用函数连接型神经网络 ( FLN)对 Ln3+离子的 EDTA等络合常数 lg K、水化能 ΔH、水解常数 p K1 及氢氧化物溶解度 p Km 分别进行非线性关联... 详细信息

以 Ln3+ 离子的半径、电负性、 4 f电子排布周期因子 q(本文自定义 )以及基态 L值等为参数 ,使用函数连接型神经网络 ( FLN)对 Ln3+离子的 EDTA等络合常数 lg K、水化能 ΔH、水解常数 p K1 及氢氧化物溶解度 p Km 分别进行非线性关联和预测 ,获得了非常好的结果 .与对应的线性模型比较表明。

关键词：镧系金属离子定量构效关系 QSPR 函数连接型神经网络非线性关联 EDTA 配合物

金属离子水解常数pK_1的人工神经网络研究

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无机化学学报 2004年第11期20卷 1334-1338页

作者：杨兴华印春生湖南怀化学院化学化工系怀化418008 上海交通大学环境科学与工程学院上海200240

A functional-link net(FLN) was applied to study the relationships between the structural parameters of metal ions and their Hytrosis Constants pK1. These structural parameters such as radius, electric charge, electronegativity (electricity shouldering) and valence electron structure parameter of the metal ion. The results are satisfactory, and better than that obtained by using linearly statistic methods. Through comparing hytrolysis constants pK1 with hydration-energy ?H, the non-linear characteristic of pK1 have deeply discussed. 19 unknown pK1 of metal ion were predicted with the method.

关键词：金属离子水解常数人工神经网络结构水溶液化学

小反刍兽疫病毒N蛋白抗原表位多肽的合成及竞争ELISA方法的建立

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小反刍兽疫病毒N蛋白抗原表位多肽的合成及竞争ELISA方法的建立

作者：印春生中国兽医药品监察所

学位级别：硕士

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种重大烈性传染病，主要发生于山羊和绵羊等小反刍兽，在国际上已经引起广泛的重视。由于周边国家小反刍兽疫的疫病流行趋势十分严峻，在我国开展小反刍兽疫的病原学、流行病学和疫病诊断的研究具... 详细信息

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种重大烈性传染病，主要发生于山羊和绵羊等小反刍兽，在国际上已经引起广泛的重视。由于周边国家小反刍兽疫的疫病流行趋势十分严峻，在我国开展小反刍兽疫的病原学、流行病学和疫病诊断的研究具有重要意义。本研究根据生物信息学技术原理，应用计算机软件对小反刍兽疫(PPR)病毒的N蛋白的理化性质、二级结构的特性以及蛋白抗原性进行综合分析，并预测出N蛋白的9段可能抗原表位。通过PS3型多肽合成仪，采用Fmoc固相合成原理对其中3条抗原性较强的抗原表位进行化学合成。通过间接ELISA法进行了初步鉴定，合成的3条抗原表位多肽(Pep1、Pep2和Pep3)都能够和小反刍兽疫的阳性动物血清反应，且其中的Pep2多肽能够区分PPR和RP的阳性血清，是PPR病毒N蛋白的特异性抗原表位。将Pep2多肽偶联到KLH蛋白载体上，分三次不同的免疫途径进行免疫6-8周龄Balb／C小鼠。三免后的第三天，采集免疫小鼠的脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合，采用HAT选择性培养。经多次间接ELISA方法筛选得到能够稳定分泌阳性抗体的15株细胞。再经一系列的克隆筛选和鉴定，其中的4F11单克隆细胞含有96条染色体，分泌的单抗为IgG2a亚型，杂交瘤细胞上清单抗的效价达1：256，小鼠腹水单抗的效价为1：2048。通过竞争ELISA方法进行鉴定，单抗能够区分PPR和牛瘟(RP)病毒感染的阳性血清，具有很好的特异性。将Pep2多肽偶联到BSA蛋白载体上，作为PPR竞争ELISA的包被抗原，以4F11单克隆细胞分泌的单抗作为竞争单抗，建立了PPR竞争ELISA方法。应用建立的竞争ELISA方法对381份血清样品进行检测，结果表明所建立的竞争ELISA方法和OIE的标准竞争ELISA试剂盒的总符合率为96.85％。

关键词：小反刍兽疫N蛋白抗原表位多肽合成与鉴定单抗制备竞争ELISA