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蜱在非洲猪瘟传播中的作用及对中国的潜在威胁

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病毒学报 2024年第3期40卷 658-670页

作者：王振忠李金明胡永新齐传翔吴晓东钱莺娟王志亮南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室江苏省外国专家工作室南京210095 中国动物卫生与流行病学中心青岛266000

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染家猪和欧亚野猪引起的一种传染性强、死亡率高的病毒性疾病。2018年,ASF传入中国,短时间内在中国的多个省份暴发和流行,给中国养猪业造成重... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染家猪和欧亚野猪引起的一种传染性强、死亡率高的病毒性疾病。2018年,ASF传入中国,短时间内在中国的多个省份暴发和流行,给中国养猪业造成重大损失。经过几年的时间,ASF在中国得到有效控制。ASFV是目前已知的唯一的虫媒DNA病毒,软蜱在ASF的传播过程中起重要作用。国外已有ASFV在软蜱体内复制并将病毒传染给猪的报道,中国尚缺乏这方面的系统研究,其给ASF防控带来的风险有待评估。本文将就蜱在ASF传播中的作用和中国的蜱感染并传播ASF的潜在能力进行分析,以期为我国ASF的综合防控提供参考。

关键词：非洲猪瘟蜱病毒传播风险评估

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依福地平对猪流行性腹泻病毒的抑制作用研究

畜牧与兽医 2024年第3期56卷 62-68页

作者：张财盛陈欢司安琪赵普齐传翔钱莺娟郑龙三戴建君南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室/农业农村部细菌学重点实验室江苏南京210095

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是猪流行性腹泻(PED)的病原。本研究通过CCK-8、细胞ELISA、Western blot、时间过程分析、药物抑制病毒吸附和入胞试验,探究了依福地平对PEDV的抑制作用。结果表明,依福地平在2... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是猪流行性腹泻(PED)的病原。本研究通过CCK-8、细胞ELISA、Western blot、时间过程分析、药物抑制病毒吸附和入胞试验,探究了依福地平对PEDV的抑制作用。结果表明,依福地平在20μmol/L浓度范围内,对Vero-E6和Marc-145细胞毒性较低;Western blot结果表明,依福地平能够显著降低宿主细胞中PEDV-N蛋白水平,主要抑制PEDV感染的入胞阶段。研究还发现,依福地平能抑制Ⅰ型单纯疱疹病毒和猪伪狂犬病毒感染宿主细胞,是一类潜在的广谱抗病毒药物。

关键词：猪流行性腹泻病毒依福地平病毒入胞广谱抗病毒效应

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犬细小病毒样颗粒的制备及免疫原性分析

中国兽医科学 2024年第1期54卷 19-25页

作者：王傲陈欢苗雨润赵普李家俊郑龙三戴建君印春生钱莺娟南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室江苏省外国专家工作室江苏南京210095 中国兽医药品监察所北京100081

犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)引起犬的一种急性、高度传染性和致死性的病毒性疾病。该病主要通过接种疫苗预防,没有特效治疗方法。为了制备犬细小病毒样颗粒(virus like particles,VLPs),本研究通过杆状病毒表达... 详细信息

犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)引起犬的一种急性、高度传染性和致死性的病毒性疾病。该病主要通过接种疫苗预防,没有特效治疗方法。为了制备犬细小病毒样颗粒(virus like particles,VLPs),本研究通过杆状病毒表达系统表达CPV VP2蛋白。将表达后的蛋白经过蔗糖密度梯度离心法纯化后,负染色处理置于透射电子显微镜下观察。结果显示VP2蛋白组装成直径25 nm左右的六边形或圆形样VLPs。血凝试验表明,该VLPs可以凝集猪红细胞,血凝价为27。进一步将该VLPs经弗氏佐剂乳化后免疫小鼠,血凝抑制试验结果显示VLPs可诱导小鼠产生211的血凝抑制抗体。因此,通过杆状病毒表达系统表达VP2蛋白,VP2蛋白可在细胞内组装成与病毒粒子类似的VLPs,该VLPs可以诱导小鼠产生血凝抑制抗体,为CPV VLPs疫苗的制备奠定了基础。

关键词：犬细小病毒 VP2蛋白杆状病毒病毒样颗粒

非洲猪瘟病毒p30和pK205R双抗原间接ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2024年

作者：何佳依邹艳丽王燕刘珊苗雨润任炜杰王振忠白昀陈欢贾红郑龙三吴晓东冯志新钱莺娟中国农业科学院北京畜牧兽医研究所南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部动物细菌学重点实验室中国动物卫生与流行病学中心国家非洲猪瘟参考实验室江苏省农业科学院兽医研究所

为建立一种可靠、快速的血清学检测方法，以非洲猪瘟病毒（ASFV）结构蛋白p30和非结构蛋白pK205R作为包被抗原，建立了一种双抗原间接ELISA方法，用于检测ASFV抗体。结果表明，该方法与伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原... 详细信息

为建立一种可靠、快速的血清学检测方法，以非洲猪瘟病毒（ASFV）结构蛋白p30和非结构蛋白pK205R作为包被抗原，建立了一种双抗原间接ELISA方法，用于检测ASFV抗体。结果表明，该方法与伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪圆环病毒和猪瘟病毒等常见猪源病原阳性血清无交叉反应；对ASFV阳性血清的敏感性能达到1︰12800；批内变异系数为7.95%，批间变异系数为9.18%，均小于10%。利用该方法与***商品化ELISA试剂盒分别检测130份临床猪血清，其阳性符合率为92.19%，阴性符合率为86.36%，总符合率为89.23%。综上所述，本研究成功建立了ASFV p30和pK205R双抗原间接ELISA检测方法，为检测猪血清中ASFV特异性抗体提供了新的技术支持。

关键词：非洲猪瘟病毒 p30蛋白 pK205R蛋白间接ELISA

串联表达GA株MDV gB主要表位基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护作用

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串联表达GA株MDV gB主要表位基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护...

作者：钱莺娟南京农业大学

学位级别：硕士

根据已发表文献及DNAstar软件分析，选取GA株马立克氏病病毒(MDV)BamHI-I区糖蛋白B 250-460位氨基酸为目的片段，进行串联表达。根据GenBank发表的序列，Primer5.0软件的辅助下分别设计两对引物Primer(U)、Primer(U)和Primer(D)、Primer... 详细信息

根据已发表文献及DNAstar软件分析，选取GA株马立克氏病病毒(MDV)BamHI-I区糖蛋白B 250-460位氨基酸为目的片段，进行串联表达。根据GenBank发表的序列，Primer5.0软件的辅助下分别设计两对引物Primer(U)、Primer(U)和Primer(D)、Primer(D)，并在上游片段5’端加上ATG GCG、下游片段5’端设计一个长9个氨基酸的linker(GSLAGALGL)和下游片段3’端加上TAA，使上游片段和下游片段串联后形成一个完整的阅读框。用PCR扩增出上游片段gB(U)和下游片段gB(L／D)。将PCR产物分别克隆入pBluescriptSKⅡ+，构建成pSKgB(U)和pSKgB(L／D)。从pSKgB(U)以XbaⅠ+BamHⅠ酶切出gB(U)，克隆入pSKgB(L／D)，构建成pSKgB(U／L／D)。然后从pSKgB(U／L／D)中以XbaⅠ+PstⅠ酶切出串联片段gB(U／L／D)，克隆入pEFgpt12S，构建成pEFMDgB(U／L／D)重组鸡痘病毒转移质粒栽体。确定转染时亲本毒的用量及筛选重组病毒选择性培养基中霉酚酸的浓度后，用磷酸钙共沉淀法，将鸡痘病毒转移质粒载体pEFMDgB(U／L／D)与鸡痘病毒FPV 282E4株在次代CEF上进行同源重组，将目的基因导入FPV ORF1区。用霉酚酸法连续筛选10代获得重组病毒rFPV-MDgB(U／L／D)。用间接免疫荧光试验(IFA)鉴定，可见阳性重组病毒表达产物产生特异性荧光，表明重组病毒成功表达了串联目的片段且串联表达产物具有免疫原性：对亲本毒和重组毒的TCID试验测定结果是两者的TCID值基本一致，表明外源基因插入鸡痘病毒ORF1后不影响病毒的复制和生物学特性。将筛选到的重组鸡痘病毒rFPV-MDgB(U／L／D)继续在2％MEM中5代，测定重组病毒分别在选择性培养基和普通培养基中的病毒滴度，并与亲本毒的滴度相比较，结果基本一致，说明重组病毒已得到了纯化且比较稳定。用rFPV-MDgB(U／L／D)+CVI988(商品苗)和CVI988(商品苗)分别免疫1日龄SPF鸡，8日龄时用RB1B株超强毒MDV攻毒，隔离饲养9周，在此期间，剖检死亡鸡，检查记录MD的病变情况，并每周每组取2-3只鸡采血制备血清和每只鸡采翅部羽毛6根，饲养9周后全部扑杀存活鸡，统计记录MD的发病情况。疫苗对RB1B株MDV在羽毛囊中复制的影响的AGP测定结果为两试验组疫苗免疫均可抑制RB1B株超强毒MDV羽毛囊排毒;攻毒后血液中MDV抗体水串联表达GA沐MDv gB主要表位荃因重组鸡痘病毒的构建及其免没保护作用平的AGP检测结果是在疫苗免疫后的第三周开始试验鸡体内MOV抗体水平逐步稳定上升;疚苗免疚效果的结果是两种疫苗免疚后均能保护试验鸡抵抗RBIB株超强毒MOv 的感染，与攻毒对照组的差异显著，但两试验组的差异不显著.

关键词：马立克氏病病毒糖蛋白B 250-460位氨基酸重组鸡痘病毒免疫保护效果

两性霉素B对猪流行性腹泻病毒入胞的抑制作用研究

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畜牧与兽医 2023年第2期55卷 73-79页

作者：赵普陈欢张财盛明鑫钱莺娟戴建君郑龙三南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室/农业部细菌学重点实验室/江苏省外国专家工作室江苏南京210095

通过测定两性霉素B(amphotericin B,AmpB)的细胞毒性、半数抑制浓度以及利用Western blot、间接免疫荧光、空斑形成、内吞等试验方法探究AmpB对猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的抑制作用及其分子机制。结果显示:20μmol/L浓度范围内,AmpB对... 详细信息

通过测定两性霉素B(amphotericin B,AmpB)的细胞毒性、半数抑制浓度以及利用Western blot、间接免疫荧光、空斑形成、内吞等试验方法探究AmpB对猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的抑制作用及其分子机制。结果显示:20μmol/L浓度范围内,AmpB对Vero-E6和Marc145细胞毒性极低;在Vero-E6细胞,AmpB对PEDV HLJBY和CV777毒株的半数抑制浓度(IC_(50))分别为0.5和0.3μmol/L,在Marc145细胞,AmpB对HLJBY和CV777的IC_(50)均为0.3μmol/L;AmpB处理几乎能阻断病毒感染细胞;AmpB主要抑制PEDV入胞和细胞巨胞饮作用。本研究为研制抑制PEDV或广谱抑制冠状病毒药物提供了新线索。

关键词： PEDV 两性霉素B 病毒入胞巨胞饮

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蓝舌病病毒小反刍兽疫病毒羊口疮病毒和山羊痘病毒多重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2022年第12期52卷 1510-1517页

作者：勾倩倩杜吉革朱真陈小云赵辉赵洋钱莺娟印春生中国兽医药品监察所北京100081 南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

为建立一种能够同时检测蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊口疮病毒(ORFV)和山羊痘病毒(CaPV)的方法,基于TaqMan探针技术,分别以NS3、N、F1L和P32为靶基因设计特异性探针和引物。以特异性引物扩增目的基因并构建重组质粒标准... 详细信息

为建立一种能够同时检测蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊口疮病毒(ORFV)和山羊痘病毒(CaPV)的方法,基于TaqMan探针技术,分别以NS3、N、F1L和P32为靶基因设计特异性探针和引物。以特异性引物扩增目的基因并构建重组质粒标准品。通过优化反应体系建立多重荧光定量PCR检测方法,并用此方法检测临床样品。结果显示,该多重荧光定量PCR标准曲线呈线性关系,对BTV、PPRV、ORFV和CaPV的扩增效率分别为100%、91%、91%、95%;该方法具有较高的灵敏性和特异性,对BTV、PPRV、ORFV和CaPV阳性质粒的最低检出量分别为17、12、8和9 copies/μL,与口蹄疫病毒、腐败梭菌、布鲁菌及弓形虫无交叉反应;其重复性较好,组间变异系数和组内变异系数均小于5%。对232份样品进行检测,用该多重荧光定量PCR分别检出9份BTV、3份PPRV、3份CaPV和24份ORFV阳性样品,而用常规PCR分别检出7份BTV、3份PPRV、0份CaPV、12份ORFV阳性样品。综上,该方法能够同时检测BTV、PPRV、ORFV和CaPV,可用于羊病的鉴别诊断、流行病学调查和疫病防控。

关键词：蓝舌病病毒小反刍兽疫病毒羊口疮病毒山羊痘病毒多重荧光定量PCR

鸭坦布苏病毒Capsid蛋白原核表达及多克隆抗体制备

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中国畜牧兽医 2023年第6期50卷 2395-2402页

作者：焦琳琳成玉婷吴庆国吴双吴植朱善元钱莺娟南京农业大学教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室南京210095 江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室江苏现代畜牧与新兽药工程技术中心泰州225300

【目的】本研究选择原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)核衣壳蛋白(Capsid protein),并制备其多克隆抗体,为DTMUV分子机制研究奠定基础。【方法】根据DTMUV-201909株基因序列,运用一步克隆技术将Capsid基因克隆至... 详细信息

【目的】本研究选择原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)核衣壳蛋白(Capsid protein),并制备其多克隆抗体,为DTMUV分子机制研究奠定基础。【方法】根据DTMUV-201909株基因序列,运用一步克隆技术将Capsid基因克隆至表达载体pET-30a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;使用ISA206佐剂与纯化后的重组蛋白混合乳化后免疫BALB/c小鼠,以获得多克隆抗体。间接ELISA方法测定获得的多克隆抗体效价,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)验证。【结果】试验成功构建pET-30a-Capsid重组质粒,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白大小约为18 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应,具有良好反应原性。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗Capisd蛋白多克隆抗体效价可达1∶256000;Western blotting和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别DTMUV感染细胞样品的Capsid蛋白。【结论】本研究成功制备小鼠抗Capsid蛋白多克隆抗体,为深入研究DTMUV Capsid蛋白的结构和功能提供了试验材料,为进一步阐明DTMUV的致病机制奠定基础。

关键词：鸭坦布苏病毒(DTMUV) 核衣壳蛋白原核表达多克隆抗体

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兔出血症病毒1、2型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立和应用

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江苏农业科学 2023年第18期51卷 40-44页

作者：王冠萱陈萌萌仇汝龙范志宇胡波宋艳华魏后军葛雷徐为中王芳钱莺娟江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程重点实验室江苏南京210014 南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室/农业农村部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)的急性致死性传染性疾病。RHDV属于杯状病毒科(Calicivirus)兔病毒属(Lagovirus)。目前兔出血症病毒1型(GI.1)和兔出血症病毒2型(GI.2)2种基因型均有在我国流行。为了更好地进行流行病学调查、实时监测兔出血症发展趋势和临床诊断,建立了一种检测RHDV1型和RHDV2型病原的快速、简单、特异且敏感的Taq Man实时PCR。结果显示,稀释度为1×10^(8)~1×10^(4) copies/μL标准品建立的标准曲线有良好的线性关系,决定系数r^(2)为0.999;该方法对RHDV1型和RHDV2型具有高度特异性,与兔多杀性巴氏杆菌、兔支气管败血波氏菌等其他病原没有任何交叉反应;检测灵敏度为100~1000 copies/μL;组内和组间变异系数在0.01%~1.61%之间。用该方法对60份临床肝脏样品和52份鼻肛拭子样本进行检测,结果显示,RHDV检出率为70.5%,敏感性显著高于普通RT-PCR方法(51%)。因此,该方法能够同时检测RHDV1型和RHDV2型,可用于鉴别诊断兔出血症病毒。

关键词：兔出血症病毒1型兔出血症病毒2型双重TaqMan qPCR