厌氧真菌阿魏酸酯酶基因表达及其生物学功能研究
作者单位：国家动物消化道营养国际联合研究中心江苏省消化道营养与动物健康重点实验室南京农业大学消化道微生物研究室
会议名称：《第十二届中国酶工程学术研讨会》
会议日期：2019年
学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学]
基 金：国家自然科学金面上项目(31772627) 中央高校基本科研业务费(KYDK201701)
摘 要：本研究旨在表达纯化厌氧真菌的一种阿魏酸酯酶,并分析其相关特性和功能,为实现其在生产中应用提供理论依据。试验利用基因组学技术获取了能够在大肠杆菌（DE3）中高效表达的阿魏酸酯酶基因序列,将其导入表达质粒并在宿主菌株内表达后,通过亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤法得到纯化的重组酶蛋白。在此基础上,通过定点突变技术,对阿魏酸酯酶基因序列中编码酯酶及糖苷水解酶的功能区分别做定点突变,并获取相应的纯化酶蛋白,比较分析几种酶的基本特性及其对不同底物的降解能力。本研究阿魏酸酯酶的基因序列为1878bp,其编码的酶蛋白包含625个氨基酸,理论等电点为5.93,不稳定系数是15.36,为稳定性蛋白。该酶催化底物的最适温度及pH值分别为37°C和7.5,野生型阿魏酸酯酶（WT）、酯酶区突变酶（TM1）及糖苷水解酶区突变酶（TM2）的分子量分别为67.80KDa、67.78KDa和67.74KDa。多糖类底物降解结果显示,TM1对多糖类底物的降解能力显著高于酶WT和酶TM2（P0.05）,TM2几乎丧失了对多糖类底物的降解能力。酯类物质及阿魏酰基低聚糖的降解结果显示,WT的降解能力均显著高于酶TM1和TM2（P0.05）;TM1和TM2都表现出极低的酯酶活性,且两者间差异不显著（P0.05）。综上,本研究成功地表达纯化出了厌氧真菌阿魏酸酯酶及其突变酶。通过定点突变发现,野生型阿魏酸酯酶中糖苷水解酶功能区的失活使得酶的多糖降解能力几乎丧失,但酯酶功能区的失活会显著增强酶对多糖类底物的降解,而两种突变酶在降解含酯键的底物上都表现出极低的活性。由此推测,在降解多糖类底物上,该酶的酯酶功能区会抑制糖苷水解酶功能区的活性。但在降解含酯键的底物上,这两个功能区表现出强烈的互作效应。