基于MDCKII细胞的体外肾毒性生物标志物评价
作者单位：中国医学科学院北京协和医学院 中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心药物非临床安全评价研究北京市重点实验室 中国食品药品检定研究院
会议名称：《2016年第六届全国药物毒理学年会》
会议日期：2016年
学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学]
基 金：基金项目 符合中药特点的有毒中药安全性评价关键技术研究(2015ZX09501004-002)
摘 要：目的由于对肾毒性物质的靶器官选择性,高通量肾脏体外模型已经逐渐成为用于药物肾毒性研究的一个重要替代方法。用犬肾远端小管上皮细胞系（MDC KII）研究药物的肾毒性和生物标志物的表达,探讨其作为评价药物肾毒性替代方法的可能性。方法研究已知具有明显肾毒性的药物庆大霉素、顺铂、环孢素和马兜铃酸I对细胞的毒性作用,以及相关酶学指标和生物标志物的表达。用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测细胞的存活率计算IC50,倒置相差显微镜观察细胞的形态,流式细胞仪分析细胞的凋亡,全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶（LDH）、碱性磷酸酶（ALP）和γ-谷氨酰转移酶（GGT）的变化,液相芯片多因子检测生物标志物肾损伤因子（KIM-1）,半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatin C）、丛生蛋白（Cluisterin）,骨桥素（Osteopontin）,中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）,单核细胞趋化蛋白（MCP-1）和白介素-8（IL-8）的表达,Real-Time PCR进一步验证生物标志物的mRNA水平。结果 MDCKII细胞系在庆大霉素、顺铂、环孢素和马兜铃酸I作用24 h的IC50分别为（18.0±1.0）mmol·L-1,（30.1±1.0）μmol·L-1,（19.6±1.2）μmol·L-1和（17.5±1.5）μmol·L-1;庆大霉素（20.0 mmol·L-1）,顺铂（30μmol·L-1）,环孢素（20μmol·L-1）和马兜铃酸I（20μmol·L-1）分别与MDCKII细胞作用24 h,倒置相差显微镜下观察到细胞皱缩,部分脱落;分别将顺铂（10,20μmol·L-1）作用于MDCKII细胞24 h,凋亡细胞由12.8%增加至17.6%;马兜铃酸I（4,8μmol·L-1）,环孢素（4,8μmol·L-1）,顺铂（5,10μmol·L-1）和庆大霉素（4,8 mmol·L-1）分别与MDCKII细胞作用6,24和48 h后,生化检测结果显示与对照组相比,给药后细胞上清中ALP的表达并无显著性差异,GGT和LDH的表达有显著的统计学差异;液相芯片多因子检测结果显示KIM-1,NGAL,Cystatin C,MCP-1和IL-8均有表达,但与对照组相比,并无显著性差异,Osteopontin和Clusterin的蛋白和mRNA表达有显著的统计学差异。结论肾毒性药物庆大霉素、顺铂、环孢素、和马兜铃酸I对MDCKII细胞具有明显的细胞毒性,Osteopontin和Clusterin的表达具有一定的灵敏度,可作为MDC KII细胞模型的肾毒性评价指标,在新药研发早期进行体外肾毒性快速筛选。