大鼠VGLUT2基因shRNA慢病毒载体的构建、鉴定及转染原代培养神经元对VGLUT2表达的影响
作者单位：第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室暨梁銶琚脑研究中心
会议名称：《中国神经科学学会第十届全国学术会议》
会议日期：2013年
学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学]
关 键 词：2型囊泡膜谷氨酸转运体 慢病毒载体 原代培养神经元
摘 要：目的构建可以表达针对2型囊泡膜谷氨酸转运体（vesicular glutamate transporter 2,VGLUT2）shRNA的慢病毒载体,探讨新构建的慢病毒载体能否有效地感染大鼠皮层和脊髓原代培养神经元,并鉴定其对培养神经元内VGLUT2基因的特异性干扰效果。方法（1）在体外合成四对互补并靶向作用于编码大鼠VGLUT2序列四个位点的特异性短发卡RNA序列（VGL,UT2-shRNA-1,2,3,4）和一个阴性对照的寡核苷酸,克隆到pGCSIL-GFP质粒载体内,经酶切及测序鉴定正确后,将其与辅助质粒共转染T293细胞,包装得到病毒颗粒。（2）将各组病毒载体分别转染原代培养的大鼠皮层和脊髓神经元,感染实验共分为以下6组:1-4组分别为pGCSIL-GFP-VGLUT2-shRNA-1组、2组、3组、4组;pGCSIL-GFP-VGLUT2-shRNA-阴性对照组和空白对照组。运用免疫荧光和Western blot方法检测各组蛋白的表达水平,并筛选出下调效果最佳的病毒载体。结果（1）pGCSIL-GFP质粒克隆得到的VGLUT2 shRNA序列正确,包装得到的病毒可以有效地感染大鼠皮层和脊髓原代培养神经元;（2）免疫荧光检测结果显示:pGCSIL-GFP-VGLUT2-shRNA-1、2、3、4组和阴性对照组共5组皮层和脊髓原代培养神经元均能观察到明显的GFP荧光,表明这些神经元已被慢病毒载体高效转染;其中第3组和第4组神经元VGLUT2的免疫荧光强度明显低于1、2组、正常组和阴性对照组,表明第3、4组能够更有效地降低原代培养神经元内VGLUT2的免疫荧光强度。（3）Western blot结果显示:pGCSIL-GFP-VGLUT2-shRNA-1、2、3、4组的VGLUT2蛋白的表达量与正常组和阴性对照组相比明显有所下降,分别占正常组的63.9±5.82%,73.8±3.18%,39.1.8±1.99%和35.1.8±1.72%;且pGCSIL-GFP-VGLUT2-shRNA-3、4组的VGLUT2蛋白的表达量明显低于pGCSIL-GFP-VGLUT2-shRNA-1、2组（P0 05）;但阴性对照组与正常组相比亦无明显差异（P0.05）。结论本研究成功构建出表达针对大鼠VGLUT2基因shRNA的慢病毒载体,并可有效下调VGLUT2的表达,为进一步在体研究VGLUT2的功能提供了有力的工具。