巢式聚合酶链反应(Nested PCR)检测武汉单极虫病方法的建立

作     者：柴下 陆宏达 

作者单位：上海海洋大学水产学院国家水生动物病源库 

会议名称：《中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会》

会议日期：2013年

学科分类：09[农学] 0906[农学-兽医学] 

关 键 词：武汉单极虫 巢式聚合酶链反应 检测 常规PCR 灵敏度 

摘      要：应用巢式聚合酶链反应(Nested PCR)立了一种检测异育银鲫武汉单极虫(Thelohanellus wuhanensisum)病的方法。采用液氮、热水浴反复冻融裂解、酚/氯仿抽提及冰乙醇沉淀法纯化武汉单极虫作为模板DNA,第一次扩增采用单极虫通用引物:5’-CTGCGGACGGCTCAGTAAATCAGT-3’和5’-CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA-3’;第二次扩增依据武汉单极虫18S rRNA序列高度保守区设计特异性引物:5’-ACCCACTTCTGTGGCCTTTC-3’和5’-AATCCGACCTACAACGCTGG-3’。结果表明,采用巢式PCR最低核酸DNA检测量仅10 fg,比常规PCR检测的灵敏度至少高1000倍。因此,所建立的巢式聚合酶链反应检测方法适合于武汉单极虫病的诊断和流行病学调查。