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巢式聚合酶链反应技术在流感嗜血杆菌b型检测中的应用

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中国感染与化疗杂志 2006年第1期6卷 18-21页

作者：姜敏胡翼云高薇袁林沈叙庄俞桑洁杨永弘首都医科大学附属北京儿童医院儿科研究所微生物室北京100045

目的评价巢式聚合酶链反应(nested-PCR)技术在b型流感嗜血杆菌(Hib)检测中的应用价值,估计氨苄西林耐药Hi中b型的比率。方法对2000—2003年北京、上海、广州细菌监测项目中,呼吸道感染儿童鼻咽部分离培养的899株Hi,用E试验法检测氨苄西... 详细信息

目的评价巢式聚合酶链反应(nested-PCR)技术在b型流感嗜血杆菌(Hib)检测中的应用价值,估计氨苄西林耐药Hi中b型的比率。方法对2000—2003年北京、上海、广州细菌监测项目中,呼吸道感染儿童鼻咽部分离培养的899株Hi,用E试验法检测氨苄西林耐药情况后,用nested-PCR与玻片凝集法对氨苄西林耐药菌株进行b型检测。结果检出74株氨苄西林耐药Hi。nested-PCR与玻片凝集法检测Hib的结果一致,74株氨苄西林耐药Hi中有2株为Hib,约占2.7%。结论nested-PCR b型荚膜检测方法可作为玻片凝集法的一个重要补充。3地4年内呼吸道感染的儿童鼻咽部携带的氨苄西林耐药Hi中,Hib的比率处于相对较低的水平。

关键词： b型流感嗜血杆菌巢式聚合酶链反应玻片凝集法

巢式聚合酶链反应结合Real-time聚合酶链反应用于检测百日咳鲍特菌方法建立及应用

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中国疫苗和免疫 2017年第2期23卷 177-181页

作者：聂丹文聂富高源朱兵清徐丽李月张秋莹邵祝军中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206 随州市疾病预防控制中心湖北随州441300 随县疾病预防控制中心湖北随县441304 随州市中心医院湖北随州441300

目的建立一种具有高敏感性、高特异性的百日咳鲍特菌聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法以百日咳鲍特菌插入序列IS481为目的基因,通过Primer5.0软件设计巢式PCR(Nested PCR,nPCR)外引物,并优化扩增条件和程序,... 详细信息

目的建立一种具有高敏感性、高特异性的百日咳鲍特菌聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法以百日咳鲍特菌插入序列IS481为目的基因,通过Primer5.0软件设计巢式PCR(Nested PCR,nPCR)外引物,并优化扩增条件和程序,结合IS481目的基因的检测方法,建立nPCR结合Real-time PCR(rPCR)检测百日咳鲍特菌的方法,应用于354份流感样病例标本核酸检测和34份临床疑似百日咳病例标本核酸检测。结果该结合检测方法的最低检出限为0.225 copies/μL,能同时检测百日咳鲍特菌和霍氏鲍特菌,其他参考菌株均呈阴性,具有较好的特异性,进一步通过rPCR区分霍氏鲍特菌。采用该结合检测技术,354份流感样病例核酸标本中17份百日咳鲍特菌阳性,34份临床疑似百日咳病例核酸标本中12份百日咳鲍特菌阳性,而单独针对百日咳鲍特菌的rPCR方法分别仅检测出1份和6份阳性,rPCR检出的阳性标本,本方法均可检出。结论基于IS481基因的nPCR结合rPCR方法可用于百日咳鲍特菌的检测,具有较高的敏感性和特异性特点。

关键词：巢式聚合酶链反应 Real-time聚合酶链反应百日咳

巢式聚合酶链反应检测A组轮状病毒基因型的研究

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检验医学 2007年第4期22卷 377-379页

作者：林勇李敏马慧丽蒋晓飞复旦大学医学院附属华山医院检验医学中心上海200040

目的用巢式聚合酶链反应(PCR)对A组轮状病毒常见G、P基因型进行检测。方法根据A组轮状病毒不同型别共有的VP4、VP7基因设计的引物分别用于G、P分型的第1次PCR扩增,然后用可以区分不同G型和P型的A组轮状病毒的引物进行第2次PCR扩增。对... 详细信息

目的用巢式聚合酶链反应(PCR)对A组轮状病毒常见G、P基因型进行检测。方法根据A组轮状病毒不同型别共有的VP4、VP7基因设计的引物分别用于G、P分型的第1次PCR扩增,然后用可以区分不同G型和P型的A组轮状病毒的引物进行第2次PCR扩增。对不同型别A组轮状病毒标准毒株和68例A组轮状病毒腹泻的粪便标本进行了G、P型别的检测。结果不同型别A组轮状病毒标准毒株分别扩增出不同长度片段的条带。68例被检测的A组轮状病毒腹泻粪便标本中G分型以G3为主,P分型以P8为主,其余型别少见。结论巢式PCR检测A组轮状病毒基因型的分型具有较高的灵敏度,操作简便快速,适用于临床检测。

关键词：轮状病毒巢式聚合酶链反应基因型

巢式聚合酶链反应检测感染树鼩中乙型肝炎病毒DNA

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现代预防医学 2007年第14期34卷 2627-2629页

作者：杨春李瑗陈茂伟李丽萍曹骥梁亮苏建家广西肿瘤防治研究所实验研究部广西医科大学医学科学实验中心南宁 530021

[目的]运用巢式聚合酶链反应(Nested-PCR)检测人HBV在树鼩体内感染,并探讨Nested-PCR在树鼩感染模型研究中的意义。[方法]用本实验室自繁树鼩,无感染史,年龄在1d龄至4月龄的树鼩,经肌肉、腹腔或者股静脉等多种途径接种人HBV(约含1×107H... 详细信息

[目的]运用巢式聚合酶链反应(Nested-PCR)检测人HBV在树鼩体内感染,并探讨Nested-PCR在树鼩感染模型研究中的意义。[方法]用本实验室自繁树鼩,无感染史,年龄在1d龄至4月龄的树鼩,经肌肉、腹腔或者股静脉等多种途径接种人HBV(约含1×107HBV DNA copies/ml)。接种后定期抽血,用Nested-PCR检测血清中的HBV DNA情况。[结果]在111只感染了人HBV的树鼩血清中,经Nested-PCR检测,共有46只树鼩检测出HBV DNA,动物感染的阳性率为41.44%(46/111)。其中1～30d龄的66只树鼩检测出HBV DNA的有33只,阳性率50%;31d龄至4月龄的45只树鼩检出HBV DNA的有13只,阳性率28.89%,两者阳性率比较差异有统计学意义(P﹤0.05)。在Nested-PCR检测过程中,所有的动物血清的第1轮PCR扩增结果均为阴性,经第2轮PCR扩增则出现阳性结果。Nested-PCR扩增产物经测序证实为目的基因(HBV C区)的序列。[结论]选择幼年树鼩感染HBV,可提高树鼩的感染率;Nested-PCR比普通PCR方法更敏感、更特异,能有效的提高树鼩血清中HBV DNA的检出率,有较大的实用价值,为研究树鼩感染人HBV模型建立了一种良好的检测方法。

关键词：巢式聚合酶链反应乙型肝炎病毒树鼩

巢式聚合酶链反应快速检测贝氏柯克斯体的研究

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中华检验医学杂志 2000年第2期23卷 74-76页

作者：崔红张雪颖宫占威程聪陈香蕊军事医学科学院微生物流行病学研究所北京100071 兰州军区后勤部军事医学研究所

目的　建立特异敏感的快速检测贝氏柯克斯体的分子生物学方法。方法　采用巢式聚合酶链反应 (PCR)方法 ,进行实验室模拟检测。结果　以贝氏柯克斯体com1基因 (编码 2 70 0 0蛋白 )为靶标设计了 2对引物 ;该引物特异性实验表明仅贝氏柯... 详细信息

目的　建立特异敏感的快速检测贝氏柯克斯体的分子生物学方法。方法　采用巢式聚合酶链反应 (PCR)方法 ,进行实验室模拟检测。结果　以贝氏柯克斯体com1基因 (编码 2 70 0 0蛋白 )为靶标设计了 2对引物 ;该引物特异性实验表明仅贝氏柯克斯体特异性片段可以扩增出来 ,其余相关立克次体均扩不出 ;敏感性测试结果可检测出 1.5fg的贝氏柯克斯体DNA ,可检测出 0 .0 0 1个鸡胚半数致死量 (CELD50 )的立克次体 ;以 10 0 0 0个CELD50 立克次体感染小鼠时 ,可于 2 4h在脾脏中检测出贝氏柯克斯体 ,检出率为 83.3% ;对人工模拟的灭菌牛奶、小鼠脏器研磨液、蜱组织研磨液、小鼠血液标本检测发现该法在牛奶和血液标本中的检测敏感性下降 3～ 4个滴度。结论　巢式PCR是快速检验贝氏柯克斯体的敏感特异的方法 ,经过进一步推广应用 ,有望应用于临床检验。

关键词：巢式聚合酶链反应贝氏柯克斯体检测

桉树焦枯病菌巢式聚合酶链反应快速检测方法的建立与应用

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2015年第5期41卷 497-504页

作者：谯天敏张静麻文建朱天辉郑磊四川农业大学林学院四川雅安625014

桉树焦枯病是威胁桉树生长的首要病害,建立准确、有效的桉树焦枯病巢式聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)快速检测技术是桉树焦枯病前期诊断的必要手段。本研究针对柱枝双孢霉(Cylindrocladium scoparium)菌株的β-微管蛋白(... 详细信息

桉树焦枯病是威胁桉树生长的首要病害,建立准确、有效的桉树焦枯病巢式聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)快速检测技术是桉树焦枯病前期诊断的必要手段。本研究针对柱枝双孢霉(Cylindrocladium scoparium)菌株的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因上保守序列极强的靶基因区域序列进行特异性引物BT-S-1/BTA-1的设计和通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A的合成,分别利用常规PCR和巢式PCR技术对引物特异性和灵敏度进行检测和比较,同时本研究也对所建立的巢式PCR用于桉树焦枯病原菌快速检测的田间时效性进行验证。试验结果表明:利用beta-tubulin基因序列通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A对全部供试菌株进行扩增,所有参试菌株均可扩增出1条约500bp的条带;而单独使用特异性引物BT-S-1/BT-A-1进行常规PCR扩增时仅病原菌能够扩增出1条148bp的明亮条带;当利用通用引物作为第1轮引物,以稀释10倍后的第1轮PCR产物作为第2轮PCR模板,利用特异性引物进行巢式PCR扩增时,也可扩增出上述148bp大小的明亮条带,且巢式PCR的扩增效果较常规PCR具有明显的视觉优越性;灵敏度检测试验表明,巢式PCR的灵敏度可检测到5fg/μL,较常规PCR可以扩增出的极限(DNA质量浓度为5pg/μL)至少提高了103倍;田间时效检测试验也说明巢式PCR较常规PCR具有更高的准确度和灵敏性,可达到田间检测的要求。本研究建立的巢式PCR检测技术可有效应用于桉树焦枯病的早期诊断。

关键词：巢式聚合酶链反应桉树焦枯病快速检测丽赤壳属柱枝双孢霉

利用巢式聚合酶链反应检测单个胚胎小体细胞中时钟基因的表达

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基础医学与临床 2006年第12期26卷 1313-1318页

作者：关云谦蔡彦宁谢淑朱宛宛徐艳玲张愚陈彪首都医科大学宣武医院老年病研究所细胞治疗室北京100053 首都医科大学宣武医院老年病研究所神经生物学室北京100053

目的建立一组灵敏的检测时钟基因(c lock gene)的巢式聚合酶链反应(nested PCR)方法,并检测小鼠胚胎小体(EB)来源的单细胞中重要时钟基因的表达情况。方法培养小鼠胚胎干细胞(mESC),体外诱导分化为EB,提取总RNA并进行反转录,用BMAL1、CL... 详细信息

目的建立一组灵敏的检测时钟基因(c lock gene)的巢式聚合酶链反应(nested PCR)方法,并检测小鼠胚胎小体(EB)来源的单细胞中重要时钟基因的表达情况。方法培养小鼠胚胎干细胞(mESC),体外诱导分化为EB,提取总RNA并进行反转录,用BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因特异引物进行巢式聚合酶链反应,电泳检测扩增产物,从而建立相应的巢式PCR反应体系。利用膜片钳获取胚胎小体来源的单个细胞,通过巢式PCR反应检测相应时钟基因的表达情况。结果确定了BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因的扩增参数。证明在此条件下无非特异扩增,并且能够检测到至少两个拷贝的目的分子。利用此检测体系发现,部分胚胎小体细胞中BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2时钟基因环路不完整。结论巢式PCR方法能够灵敏地、而且特异地从单细胞中检测出一组时钟基因的表达,时钟基因的转录在胚胎小体细胞中并不一致,即时钟基因的环路不完整。时钟基因可能在细胞分化过程中发挥着某种作用。

关键词：胚胎小体巢式聚合酶链反应时钟基因单细胞

实时定量聚合酶链反应与巢式聚合酶链反应在289例白血病融合基因检测中的比较

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中国医科大学学报 2012年第8期41卷 738-741页

作者：王玥李艳金晶纯王亚柱魏鑫中国医科大学附属第一医院血液内科沈阳110001

目的比较实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)与巢式聚合酶链反应(nPCR)在白血病融合基因BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO检测中的结果。方法分别应用RT-PCR与nPCR对289例急慢性白血病初诊和完全缓解的患者BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO融合基因... 详细信息

目的比较实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)与巢式聚合酶链反应(nPCR)在白血病融合基因BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO检测中的结果。方法分别应用RT-PCR与nPCR对289例急慢性白血病初诊和完全缓解的患者BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO融合基因进行检测,结合患者骨髓细胞形态学及临床转归予以分析。结果 46例初诊慢性粒细胞白血病(CML)患者中,RT-PCR与nPCR检测BCR/ABL融合基因阳性率分别为95.7%和93.5%(P=0.997);69例完全缓解CML患者中,RT-PCR与nPCR检测阳性率分别为78.4%和58.1%(P<0.05)。32例初诊急性早幼粒细胞白血病(APL)患者中,RT-PCR与nPCR检测PML/RARa融合基因阳性率分别为93.8%和90.6%(P=0.996);114例完全缓解APL患者中,RT-PCR与nPCR检测阳性率分别为12.3%和7.0%(P<0.05)。12例初诊急性粒细胞白血病M2(ANLL-M2)患者中,RT-PCR与nPCR检测AML1/ETO融合基因阳性率分别为50.0%和50.0%(P=1.0);16例完全缓解ANLL-M2患者中,RT-PCR与nPCR检测阳性率分别为50.0%和12.5%(P<0.05)。结论 RT-PCR较nPCR更为敏感而准确,应用RT-PCR可以提高微小残留病的检出率,为临床诊断和治疗提供更为有效的分子生物学依据。

关键词：白血病融合基因实时定量聚合酶链反应巢式聚合酶链反应

乙型肝炎病毒基因的巢式聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分型及初步应用

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中华检验医学杂志 2003年第4期26卷 226-228页

作者：黄晶高志良广东省人民医院感染科广州510080 中山大学附属三院传染科

目的　用改进的乙型肝炎病毒 (HBV)巢式聚合酶链反应限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)的基因分型方法初探广州地区HBV基因型分布状态。方法　设计巢式PCR扩增前S基因 ,经限制性内切酶AvaⅡ和DpnⅡ酶切鉴别HBVA～G基因型 ;并对 14 0份... 详细信息

目的　用改进的乙型肝炎病毒 (HBV)巢式聚合酶链反应限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)的基因分型方法初探广州地区HBV基因型分布状态。方法　设计巢式PCR扩增前S基因 ,经限制性内切酶AvaⅡ和DpnⅡ酶切鉴别HBVA～G基因型 ;并对 14 0份乙型肝炎患者血清进行基因分型 ,其中随机挑选 3份进行克隆测序 ,并对 2 0份患者血清进行巢式PCR RFLP重复分型试验 ,以验证此分型技术的稳定性和特异性。同时采用PCR和巢式PCR对 92份乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)阴性血清进行HBVDNA阳性率检测比较。结果　基因分型与测序结果一致 ;基因分型重复试验符合率10 0 % ;92份HBeAg阴性血清经PCR和巢式PCR扩增HBVDNA的阳性率分别为 2 0 7%和 6 8 5 %。14 0份乙型肝炎患者血清中HBV基因型以C型 (94份 )和B型 (4 2份 )为主 ,偶见A型 (4份 )。结论　巢式PCR RFLPHBV基因分型方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性 ,且操作简便 ,适用于临床和流行病学调查研究。

关键词：乙型肝炎病毒巢式聚合酶链反应限制性片段长度多态性基因分型