非催化结构域在模块型纤维素酶GH9和GH48中的作用机制研究

作     者：侯雪晨 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张作明

授予年度：2024年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：模块型纤维素酶 GH9 GH48 非催化结构域 激光共聚焦扫描显微镜 

摘      要：纤维素酶在木质纤维素的转化中起到了重要的作用,具有高效,绿色等特点,受到人们的广泛研究。纤维素酶通常为多模块酶,由催化结构域(Catalytic Domain,CD)和非催化结构域组成,其中,非催化结构域在酶的催化中起到了关键的作用。常见的非催化结构域比如碳水化合物结合模块(Carbohydrate binding module,CBM)的作用已被深入且成体系地研究,其具有靶向作用,临近作用,和破坏底物形态的作用。然而,还有一些其他存在于纤维素酶中的模块比如纤维连接蛋白3型模块(Fibronectin type 3 domain,FN3)未被深入研究,其对木质纤维素的水解的作用可能十分重要。 本文以来自解纤维嗜热酸菌Acidothermus cellulolyticus 11B的AcCel9B和AcCel48酶为研究对象,开展了突变体的构建,性质测定以及与不同底物的相互作用研究,具体如下:(1)以实验室中载有AcCel48基因序列的质粒为模板,设计了一系列引物,利用PCR的方法得到了具有不同模块组成的突变体基因,分别构建在质粒载体pET-28a(+)中,后在大肠杆菌中进行了异源表达,并成功使用镍柱进行纯化。(2)对AcCel48及其突变体进行了基础性质测定以及对不同底物的吸附,解吸附研究,得出结论:CBM2结构域可以提升酶在纤维素底物上的最适温度,且有利于酶对纤维素,木质素吸附作用;FN3结构域也有一定的提升酶在纤维素底物上的最适温度的功能,且有利于酶对纤维素的吸附作用,但是不利于酶与木质素底物的吸附。(3)表达并纯化了实验室前人构建的AcCel9B突变体,同上述AcCel48及其突变体分别使用蛋白染料进行染色,并开展了激光共聚焦扫描显微镜实验,观察了这些酶在天然底物上的吸附情况,发现了带有FN3结构域的酶对于木质素区域的吸附量要少于不带有FN3结构域的酶,证实了之前得到的结论,即FN3结构域可以抵抗木质素对纤维素酶的吸附。(4)通过分子对接实验发现CBM2和FN3模块通过氢键以及范德华力与纤维素底物产生作用;CBM2可以和木质素底物产生疏水相互作用,FN3结构域则不行。通过序列比对发现来自AcCel48和来自AcCel9B的FN3结构域中的带电氨基酸残基十分保守,结合前人的研究,对FN3模块可以抵抗木质素对酶的非生产性吸附的原因做出推测:FN3模块整体携带的负电荷与同样带负电荷的木质素产生了相互排斥的静电相互作用力,从而使FN3拥有一定抵抗木质素对酶的非生产性吸附的功能。 以上研究结果为更深入地认识纤维素酶的非催化结构域提供了一定的依据,为FN3模块的研究填补了一定的空白,并且为设计功能更强的纤维素酶嵌合酶提供了一个优良的结构域选择。