猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达及免疫原性评价

作     者：齐江坤 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈陆

授予年度：2024年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：PCV3 PCR检测 遗传进化分析 可溶性表达 间接ELISA方法 攻毒保护试验 

摘      要：PCV3是一种2016年首次发现的具有致病性的圆环病毒,与先前已知的PCV1、PCV2以及后来发现的PCV4在免疫反应上无交叉性。这种病毒在全球范围内广泛流行,其传播途径多样,且容易和其他病毒混感,至今PCV3尚无疫苗问世,因此PCV3疫苗研发对于疾病防控工作具有至关重要的意义。 为了解PCV3在河南地区感染现状,本试验利用PCR方法对河南省猪临床样品进行PCV3检测,对不同猪场采集的PCV3阳性病料进行测序,分析其遗传进化特征。而后利用经典大肠杆菌表达系统BL21(DE3)探究不同促溶标签和分子伴侣对PCV3 Cap蛋白可溶性的影响。随后建立基于可溶性蛋白的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为了进一步验证Cap蛋白疫苗免疫效果,本试验利用Cap蛋白疫苗免疫小鼠,并进行攻毒保护试验,评价其免疫原性。 1.河南部分地区PCV3感染情况的调查 本试验共采集2022-2023年间河南不同地区临床疑似圆环病毒病病例样本1 547份,提取病毒核酸后,用PCV3特异性引物进行PCR扩增,鉴定出PCV3阳性样品125份,阳性率为7.6%。为更深入了解PCV3毒株遗传特征和进化关系,本试验选取来自不同场区27份PCV3阳性样品进行测序和进化分析,其中,18份样品属于PCV3a型,8份属于PCV3c型,1份属于PCV3b型,结果表明,目前河南地区PCV3优势毒株为PCV3a型。进一步分析显示,125份PCV3阳性样本中,36份混感PRRSV,阳性率为28%;29份混感PCV2阳性,阳性率为23.2%;16份样品混感PRRSV、PCV2和PCV3,阳性率为12.8%。这些结果揭示了河南省PCV3的复杂感染情况。 ***3 Cap蛋白促溶标签可溶性表达及纯化 为获得可溶性表达的PCV3 Cap蛋白,本试验构建N端截短34个氨基酸PCV3 Cap基因序列,将其克隆到p MD19-T载体,通过酶切连接,将其分别连接到pET28a、pET32a、pET43.1a、pETSUMO、pET-GST、pET-MBP等6种不同的表达载体。通过对比这些表达载体的可溶性表达效果,最终选定pET-MBP载体作为表达载体。为进一步提高蛋白纯化效率,本试验对pET-MBP载体进行同源重组改造,在MBP序列N端和C端分别引入TEV蛋白酶序列和6×His序列(pET-His-MBPTEV-Cap)。通过麦芽糖结合蛋白纯化,获得pET-His-MBP-TEV-Cap重组蛋白,随后利用TEV蛋白酶对重组蛋白进行切割,得到His-MBP-TEV蛋白和Cap蛋白混合液。最后,通过Ni柱亲和层析,成功纯化得到Cap蛋白。利用PCV3猪阳性血清鉴定可溶性表达产物,Western blotting结果表明表达的Cap蛋白可与猪PCV3阳性血清反应,进一步证明重组蛋白的表达。本试验为PCV3 Cap蛋白可溶性表达提供新方法,为进一步研究其功能和应用奠定了基础。 ***3 Cap蛋白分子伴侣可溶性表达和纯化 为降低试验成本,本试验又构建分子伴侣质粒和pET28a-PCV3-Cap双质粒诱导体系,利用ptf16分子伴侣,实现PCV3 Cap蛋白的可溶性表达,并对表达条件进行优化,通过Ni柱亲和层析纯化得到PCV3 Cap蛋白。利用PCV3猪阳性血清鉴定可溶性表达产物,Western blotting结果表明表达的Cap蛋白可与PCV3猪阳性血清反应,进一步证明重组蛋白的表达。本试验极大程度降低了PCV3Cap的表达成本,为PCV3亚单位疫苗的生产奠定了基础。 ***3间接ELISA方法的建立 本试验采用分子伴侣质粒与pET28a-PCV3-Cap双质粒诱导体系中表达的可溶性的PCV3 Cap蛋白作为包被抗原,建立PCV3间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。通过一系列条件优化,确定最佳反应参数:抗原最佳包被浓度为0.8μg/ml,待检血清最佳稀释倍数为1:400,最佳封闭液为5%牛血清白蛋白(BSA),最佳血清作用时间为60 min,酶标二抗最佳稀释倍数为1:4 000,酶标二抗作用时间也为60 min。当S/P值≥0.332时,结果判定为阳性结果。敏感性试验结果为1:3 200;批内和批间差异,差异系数均小于7%。交叉反应试验结果显示,只有PCV3阳性血清呈阳性,其他如CSFV、PRRSV、PCV2等阳性血清均为阴性,证明该方法具备特异性。 ***3攻毒保护试验 为评价PCV3 Cap蛋白免疫原性,本试验利用制备的PCV3 Cap蛋白疫苗对BALB/c小鼠进行免疫,加强免疫两次后进行攻毒。结果可见,随着免疫次数增加,小鼠免疫后血清中均可产生针对PCV3特异性抗体,q PCR结果显示小鼠血液中病毒载量相较于PBS对照组明显减少。本试验证明Cap蛋白疫苗在