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猪圆环病毒2型和3型检测方法建立及初步应用

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 151-159页

作者：李桐赵润泽李博天李春琪王妍郭利伟杨小林刘国平长江大学荆州434000

为快速检测并鉴别猪圆环病毒2型(pcv2)和猪圆环病毒3型(pcv3)病毒。本文研究参考GenBank中pcv2和pcv3高度保守片段分别设计了探针引物,成功建立了一种双重TaqMan荧光定量检测方法。结果显示:该方法特异性好,可鉴别pcv2、pcv3与其他猪病... 详细信息

为快速检测并鉴别猪圆环病毒2型(pcv2)和猪圆环病毒3型(pcv3)病毒。本文研究参考GenBank中pcv2和pcv3高度保守片段分别设计了探针引物,成功建立了一种双重TaqMan荧光定量检测方法。结果显示:该方法特异性好,可鉴别pcv2、pcv3与其他猪病病毒;pcv2最低检测下限为1.00×10^(1)copies/μL,pcv3最低检测下限为1.00×10^(0)copies/μL;重复性高,批内、批间的变异系数分别为0.01%~0.02%和0.02%~0.05%;本研究采用建立的方法与商品试剂盒同步检测猪只样品440份,pcv2样品符合率为97.47%,pcv3样品符合率为96.85%;测序结果显示,pcv2均为2d亚型,pcv3均为3c亚型。结果表明,建立的双重TaqMan荧光定量检测方法具有良好的特异性、敏感性且快速、准确,节约成本,可为pcv2和pcv3的监测与防控提供技术支撑。

关键词： pcv2 pcv3 双重TaqMan qPCR方法建立混合感染

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pcv2、pcv3和pcv4三重荧光PCR鉴别检测方法的建立及应用

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中国兽医学报 2022年第9期42卷 1752-1757,1763页

作者：高艺祥王金凤张倩孙晓霞刘立兵顾文源马宏伟马增军韩庆安王建昌河北科技师范学院动物科技学院河北省预防兽医学重点实验室河北秦皇岛066004 河北省动物疫病预防控制中心河北石家庄050035 石家庄海关技术中心河北石家庄050051

根据猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,pcv2)、猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,pcv3)和猪圆环病毒4型(porcine circovirus 4,pcv4)保守区域基因序列合成特异性的引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了一种可同时快速高效鉴... 详细信息

根据猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,pcv2)、猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,pcv3)和猪圆环病毒4型(porcine circovirus 4,pcv4)保守区域基因序列合成特异性的引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了一种可同时快速高效鉴别检测pcv2、pcv3和pcv4的三重荧光PCR方法。结果显示,所建立的三重荧光PCR方法仅对pcv2、pcv3和pcv4出现阳性扩增,与猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪支原体肺炎(***).猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪常见病原无交叉反应;对***3和pcv4的最低检出限分别为1.69×10^(1),1.38×10^(2),1.42×10^(2)拷贝;组内和组间试验变异系数均小于1.6%,重复性好。进一步应用所建立的pcv2、pcv3和pcv4三重荧光PCR方法对263份猪临床样品进行检测,结果检出168份pcv2阳性(阳性率为63.88%),35份pcv3阳性(阳性率为13.31%),21份pcv4阳性(阳性率为7.98%),其中pcv2/pcv3/pcv4共感染3份(阳性率为1.14%),检测结果与单重荧光PCR方法一致。本研究所建立的pcv2、pcv3和pcv4三重荧光PCR方法可以有效的实现对pcv2、pcv3和pcv4的同时快速检测。

关键词： pcv2 pcv3 pcv4 三重荧光PCR

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Development of an indirect immunofluorescence assay for pcv3 antibody detection based on capsid protein

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Animal Diseases 2021年第2期1卷 125-132页

作者： Lun Yao Chang Li Junwei Wang Yufang Cheng Ahmed H.Ghonaim Qi Sun Xuexiang Yu Weijie Niu Shengxian Fan Qigai He State Key Laboratory of Agricultural Microbiology Huazhong Agricultural UniversityWuhanChina The Cooperative Innovation Center for Sustainable Pig Production Huazhong Agricultural UniversityWuhanChina College of Veterinary Medicine Huazhong Agricultural UniversityWuhanChina

Porcine circovirus type 3(pcv3)is a novel porcine circovirus associated with porcine dermatitis and nephritis syndrome(PDNS),reproductive failure,and multisystemic *** protein(Cap)encoded by pcv3 ORF2 gene has been identified as an immunogenic ***,there is no immunofluorescence assay(IFA)available for serological ***,the N-terminal 33 amino acids of Cap protein were predicted to serve as a pcv3 nuclear localization signal(NLS).Two types of recombinant plasmids were constructed for recombinant protein expression in 5f9 cells by using a baculovirus expression system:plasmid rvBac-Pc for full-length Cap protein expression and rvBac-Sc for Cap protein expression with a honeybee melittin signal peptide in place of the predicted NLS *** of the nuclear localization sequences was further analyzed by *** and specific fluorescence signals were observed in the nucleus of rvBac-Pc-transfected cells and in the cytoplasm of rvBac-Sc-transfected *** cross-reactivity was observed with porcine circovirus type 2,porcine pseudorabies virus,classical swine fever virus,or porcine reproductive and respiratory syndrome *** summary,we developed two fluorescence detection modes for Cap protein that can be used to detect pcv3 *** method is suitable for the diagnosis and epidemiological investigation of *** study provides a reliable detection method for monitoring pcv3 antibody level in pigs in the future.

关键词： pcv3 Capsid protein Antibodies IFA

辽宁省部分地区犬猫猪pcv3的检测和进化分析

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辽宁省部分地区犬猫猪PCV3的检测和进化分析

作者：胡婉馨沈阳农业大学

学位级别：硕士

猪圆环病毒3型(pcv3)是圆环病毒科圆环病毒属第三个被发现的新型病毒。可侵害猪消化系统、呼吸系统,和生殖系统,引起仔猪多系统炎症和母猪繁殖障碍,给生猪养殖业带来极大的危害,严重威胁养殖行业发展。从2015年,美国某猪场首次在母猪体... 详细信息

猪圆环病毒3型(pcv3)是圆环病毒科圆环病毒属第三个被发现的新型病毒。可侵害猪消化系统、呼吸系统,和生殖系统,引起仔猪多系统炎症和母猪繁殖障碍,给生猪养殖业带来极大的危害,严重威胁养殖行业发展。从2015年,美国某猪场首次在母猪体内发现pcv3病毒之后,包括中国、韩国、日本、俄罗斯、瑞典、意大利、丹麦、西班牙等国家陆续对该病毒进行报道,表明pcv3已在世界范围内广泛流行。除了在猪体内检出pcv3之外,在其它动物体中也检出了pcv3病毒。针对pcv3的流行日益严重,有必要调查本省pcv3在猪和宠物中的流行情况。方法:本研究收集了2019年至2020年辽宁省内猪组织样本、犬猫样本共188个,提取核酸后,设计特异性的pcv3引物对这些样本进行pcv3的PCR筛查,确定pcv3在猪、猫和犬中的感染情况。随后将阳性的PCR产物测序,利用MEGA软件与国内外23条pcv3序列进行氨基酸和核苷酸的比对并构建进化树,分析病毒的进化及演变关系。结果:得到辽宁省pcv3基因序列共14条,阳性率为7.45%。10条从来自于辽宁省锦州、大连、阜新、葫芦岛、铁岭、辽阳等地猪的样品,4条从猫的样品中检出。猪的阳性率为10.3%(10/97),猫的阳性率为16.7%(4/24),犬的阳性率为0(0/67)。表明猫的pcv3感染更加严重。将所获得的序列与国内外序列进行对比,核苷酸同源性98.34-100%;氨基酸同源性为99.2-100%。11条序列为pcv3c亚型,3条序列为pcv3a亚型。说明c亚型仍是主要的流行类型。ORF2氨基酸突变位点共有15个,5个主要的共有突变位点第24、27、56、77、150位;第11位突变点在马来西亚株中,其余都在国内流行株中。结论:本研究丰富了省内pcv3研究资料。首次在猫的样品中检出较高的pcv3感染情况,为跨物种的传播趋势提供了依据。

关键词： pcv3 犬猫样本 PCR检测进化树同源性分析

副猪嗜血杆菌与pcv3混合感染的实验室诊断及分析

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中国动物检疫 2022年第12期39卷 18-25页

作者：赵自亮田宇森庄鸿琨李婕朱桓奕刘霞杨晓伟张立武赵光伟西南大学动物医学院重庆402460 贵州省动物疫病预防控制中心贵州贵阳550008 重庆三杰众鑫生物工程有限公司重庆402460

为确定重庆市某患病猪场的致病原并探究其生物学特性及分子进化特性,首先利用PCR方法对组织病料进行检测,结果发现副猪嗜血杆菌(Hps)和圆环病毒3型(pcv3)两种病原场为阳性。然后进行细菌分离,通过形态、培养特征和16S rDNA测序对分离菌... 详细信息

为确定重庆市某患病猪场的致病原并探究其生物学特性及分子进化特性,首先利用PCR方法对组织病料进行检测,结果发现副猪嗜血杆菌(Hps)和圆环病毒3型(pcv3)两种病原场为阳性。然后进行细菌分离,通过形态、培养特征和16S rDNA测序对分离菌株进行鉴定,并分析其血清型、药物敏感性、耐药基因以及生长曲线等主要生物学特性。经鉴定确定致病菌株为Hps血清5型,分离菌株对头孢他啶、苯唑西林、新霉素、卡那霉素、氯霉素、米诺环素、多黏菌素B和四环素表现为耐药,共检测到9种耐药基因;对pcv3通过分段扩增、拼接获得完整的基因组序列,通过生物学软件分析其基因结构以及基因型,经测序分析发现pcv3基因组全长2 000 bp,GC含量为50.45%,基因型为pcv3a,与广西MH823221株和美国最早报道的KT869077株具有较高的亲缘关系。本研究确定了患病猪的致病原及其主要生物学特性及分子进化特性,为临床有效防控Hps和pcv3混合感染提供了依据。

关键词：副猪嗜血杆菌 pcv3 混合感染生物学特性

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pcv3抗体的间接ELISA检测方法建立及湖南省pcv3流行病学初步调查

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PCV3抗体的间接ELISA检测方法建立及湖南省PCV3流行病学初步调查

作者：谢怡灵湖南农业大学

学位级别：硕士

猪圆环病毒3(pcv3)是一种新发现的猪病病原,目前美国、中国、英国等多个国家陆续发现了pcv3的存在。结合临床症状分析,认为pcv3与猪皮炎肾病综合征(PDNS)、仔猪先天性震颤、母猪繁殖障碍和多系统炎症有关,对养猪业构成了潜在的威胁,需... 详细信息

猪圆环病毒3(pcv3)是一种新发现的猪病病原,目前美国、中国、英国等多个国家陆续发现了pcv3的存在。结合临床症状分析,认为pcv3与猪皮炎肾病综合征(PDNS)、仔猪先天性震颤、母猪繁殖障碍和多系统炎症有关,对养猪业构成了潜在的威胁,需引起养猪业的高度重视。为了全面了解湖南省猪群中pcv3感染情况,帮助猪场在非洲猪瘟背景下制定疫病综合防控措施,有必要建立一种简单、快速及易于高通量检测pcv3抗体的ELISA方法,同时对湖南省的猪群进行pcv3流行病学调查。本研究将pcv3 Cap蛋白截去核定位序列(NLS)后对应的d Cap基因克隆至p ET28-a(+)并转入大肠杆菌BL21(DE3),得到重组菌后进行蛋白表达。采用镍离子亲和层析纯化d Cap蛋白。将纯化的d Cap蛋白作为抗原进行包被,建立检测pcv3抗体的间接ELISA的方法。利用本方法对湖南省11个地级市的1175份临床血清进行检测。利用PCR方法鉴定出湖南省11个地级市的pcv3全基因组序列,并进行序列分析。结果显示,dCap蛋白主要以包涵体形式表达,将纯化的d Cap蛋白稀释到0.2μg/m L并进行包被,且血清50倍稀释,酶标二抗1:8000稀释时,ELISA的反应条件最佳,S/P临界值为0.270,批内及批间差异均小于10%,本方法与pcv2、CSFV、PRV和PRRSV阳性血清无交叉反应。对湖南省11个地级市的29个猪场的血清流行病学调查结果表明pcv3抗体猪场阳性率100.00%(29/29),样品总阳性率为58.64%(689/1175),且猪群感染pcv3普遍在肥猪阶段。猪群中pcv3抗体的S/P值在0.270～2.0之间,但70%以上的样品其S/P值在0.4以下,抗体水平均不高。本研究共得到11株pcv3全基因组序列。11株pcv3全基因组序列、Rep蛋白和Cap蛋白氨基酸序列同源性范围分别为98.6%～100.0%、98.7%～100.0%和96.3%～100.0%,与国内外毒株的同源性范围分别为97.9%～99.7%、98.3%～100.0%和95.3%～100.0%。上述结果表明本研究建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性和特异性,可用于pcv3抗体检测。通过血清和分子流行病学调查,发现湖南省猪群中pcv3感染十分普遍,且各地区的毒株同源性较高。此研究为pcv3在湖南省的流行性研究提供了科学依据。

关键词： pcv3 流行病学间接ELISA 基因进化分析

pcv3贵州流行株基因组分析及其Cap蛋白的原核表达研究

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PCV3贵州流行株基因组分析及其Cap蛋白的原核表达研究

作者：张爱琼贵州大学

学位级别：硕士

猪圆环病毒(pcv)是圆环病毒科圆环病毒属单股环状DNA病毒。根据抗原性和基因型的不同,分为pcv1、pcv2和pcv3三种血清型。pcv1最早于1974年被发现,认为是传代细胞PK-15培养的污染物,对猪不具有致病作用,在很多国家的猪体内普遍存在,而不... 详细信息

猪圆环病毒(pcv)是圆环病毒科圆环病毒属单股环状DNA病毒。根据抗原性和基因型的不同,分为pcv1、pcv2和pcv3三种血清型。pcv1最早于1974年被发现,认为是传代细胞PK-15培养的污染物,对猪不具有致病作用,在很多国家的猪体内普遍存在,而不产生临床症状。pcv2常引起以断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)为代表的猪圆环病毒相关疾病(pcvAD),给养殖业带来巨大的危害。2016年,美国的Phan T和Palinski R几乎同一时间在不同地区的农场中检测出新型圆环病毒(pcv3)。随后,pcv3在中国、韩国、巴西等10多个国家相继被检出并报道,现已成世界性分布,给养猪业带来了极大的威胁。贵州省关于pcv3的流行病学调查及相关基因研究尚未见详细报道。本研究对贵州省pcv3的流行情况进行了分子流行病学调查,基于基因组序列进行了遗传进化分析,并对pcv3唯一结构蛋白,即主要免疫原性蛋白Cap进行了原核表达研究,为血清学检测方法ELISA试剂盒的研究奠定了基础。1.贵州省猪圆环病毒3型病毒分子流行病学调查及流行株基因组分析针对pcv3 ORF2区域设计特异性引物,应用PCR扩增技术,对实验室2012018年间收集的贵州省92个规模化养殖场送检的427份样品进行了pcv3 ORF2基因的特异性扩增,并对检测结果进行了归类比较分析。结果显示在427份样品中,91份为pcv3呈阳性,并与CSFV、PRRSV、pcv2、PEDV、PRV等病毒形成双重或多重感染,其中与PRRSV双重感染率高达59.3%;贵州各个地州市均存在pcv3感染,2012018年的阳性率逐年上升;贵阳市送检样品中pcv3检出率最高,为26.1%;pcv3阳性检出率最高的猪群系保育猪群,为25%。同时,论文还对部分阳性样品进行了pcv3全基因组的克隆和序列测定,共获得11株pcv3基因组序列,基因组大小均为2 000 bp。遗传进化分析发现11株pcv3中,2株属于pcv3b型,9株属于pcv3c型,未发现有pcv3a存在;各毒株间核苷酸序列相似性在98.9%00%之间,与国外毒株核苷酸相似性在98.7%9.8%之间,与国内pcv3毒株相比核苷酸相似性在97.3%9.9%之间,与pcv2和pcv1相似性在40%左右,遗传关系较远。2.猪圆环病毒3型Cap蛋白原核表达研究为获得pcv3 Cap蛋白,通过设计特异性引物针对Cap基因进行扩增,并将其克隆至pMD19-T载体中,再通过基因工程技术酶切后亚克隆至原核表达载体pET-32a中,经质粒PCR、双酶切及测序鉴定比对正确后,转化入Rosseta(DE3)大肠杆菌表达系统中,对影响诱导的条件即时间、温度、IPTG进行优化,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹试验(Western-blotting)等对表达的pcv3 Cap蛋白进行检测。结果显示成功构建了pcv3 Cap蛋白的原核表达质粒,在最佳表达条件,即1.0 mmol/L的IPTG,37℃诱导4 h后,SDS-PAGE电泳检测可在约43.1 KDa处检测到表达的目的蛋白。通过转印将蛋白转移至PVDF膜后,以带His标签的单克隆抗体为一抗,对融合表达蛋白进行Western-blotting检测,结果显示带His标签的单克隆抗体能和融合表达的目的蛋白特异性结合并显色。本研究为pcv3血清学鉴别诊断方法建立及ELISA试剂盒的研究奠定了基础。

关键词： pcv3 分子流行病学调查 Cap蛋白遗传进化分析原核表达

pcv3 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

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PCV3 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

作者：张南乡子湖南农业大学

学位级别：硕士

2015年,美国北卡罗来纳州一商业猪场爆发了母猪繁殖障碍和猪皮炎肾病综合征(PDNS),研究人员在该猪场发现了一种新型猪圆环病毒pcv3,自此以后,中国、韩国、波兰、丹麦、西班牙、意大利和巴西等国家陆续有pcv3感染病例的检测报道。国内研... 详细信息

2015年,美国北卡罗来纳州一商业猪场爆发了母猪繁殖障碍和猪皮炎肾病综合征(PDNS),研究人员在该猪场发现了一种新型猪圆环病毒pcv3,自此以后,中国、韩国、波兰、丹麦、西班牙、意大利和巴西等国家陆续有pcv3感染病例的检测报道。国内研究发现,广东、广西、山东、湖南、湖北、辽宁和江苏等多省市地区均有pcv3感染病例报道,而且综合现有pcv3研究报道,pcv3可能与母猪繁殖障碍、PDNS、多系统炎症、心肌炎及新生仔猪震颤有关。我国猪场中广泛感染的pcv2已给养猪业造成了巨大的经济损失,在具有PDNS母猪和流产胎儿中检测出pcv3,需引起国内行业高度重视。因此,建立一种快捷简便、特异性强和灵敏度高的pcv3检测体系并探究其检测效力具有重要意义。本研究首先利用巢式PCR检测猪肺组织pcv3,PCR扩增pcv3阳性样本中cap基因全长序列,通过TA克隆技术,获得并分析其序列信息。pcv3和pcv2 Cap氨基酸序列比对分析发现,pcv3 Cap不具有PXXP基序,不含有半胱氨酸(cysteine),且在Loop CD区域缺失8个氨基酸。基于pcv3 cap基因序列,设计特异性引物,建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测技术体系,检测限为10copies/μL,检测效率(E)为94.2%,回归平方值(R)为0.998。批內及批间变异系数均小于2%,且对其他常见猪病毒(pcv2、PRV、PPV、PRRSV、PEDV、pcv1和CSFV)不敏感,具有pcv3高特异性。利用pcv3 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测技术对2015年1月016年12月间共收集的190份母猪血清样本(85份为有流产或繁殖障碍记录的母猪血清,105份为健康的母猪血清)和75份精液样本的DNA进行pcv3检测,结果显示,pcv3阳性率分别为32.63%(母猪血清)和4.0%(精液)。在pcv3阳性母猪血清样本中获得6个pcv3 cap全长序列(GenBank MG745690-MG745695),经序列分析发现,这6条序列与GenBank已报道的51条pcv3全基因组序列核苷酸同源性为969.7%。通过对pcv3毒株cap基因遗传进化研究分析发现,pcv3与pcv1和pcv2处于不同的进化分支,6个序列均属于pcv3a分支,3a和美国毒株处于相同的进化分支。在湖南地区搜集的母猪血清和精液样本中检出了新型猪圆环病毒pcv3,因此,仍需对pcv3感染情况进行全面的调查。本研究基于pcv3 cap序列成功建立了pcv3SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测技术体系,为pcv3临床诊断及未来疫苗效力评价等应用奠定实验基础,而来源于繁殖障碍母猪血清的pcv3 cap序列及其突变信息为pcv3的致病性和疫苗设计研究提供了可参考的实验基础。

关键词： pcv3 繁殖障碍 qPCR 基因进化分析

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1株犬源pcv3的全基因克隆与序列分析

中国兽医学报 2020年第3期40卷 504-509页

作者：辛佳亮汪伟杜倩韩知晓闭璟珊孔子荣张书祥孙文超曹亮鲁会军郑敏金宁一广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心广西南宁530000 温州大学病毒学研究所浙江温州325035 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122

根据GenBank上已发表的pcv3毒株序列设计1对检测引物和2对扩增全长引物。应用检测引物对广西地区的犬血清样品进行PCR检测,应用扩增全长引物对检测阳性样品进行PCR扩增、克隆和测序,并对其全基因序列进行分析,绘制遗传进化树。结果显示... 详细信息

根据GenBank上已发表的pcv3毒株序列设计1对检测引物和2对扩增全长引物。应用检测引物对广西地区的犬血清样品进行PCR检测,应用扩增全长引物对检测阳性样品进行PCR扩增、克隆和测序,并对其全基因序列进行分析,绘制遗传进化树。结果显示,广西地区147份犬血清样品中,阳性样品为36份,感染率为24.3%。本试验成功扩增1株2000bp的pcv3毒株的全基因核苷酸序列,并命名为pcv3/Guangxi-5。将pcv3/Guangxi-5序列与NCBI公布的pcv3的参考序列进行同源性比对,结果显示pcv3/Guangxi-5与参考序列的全基因序列同源性为98.9%~100.0%,其中与DE27.16同源性最低,与pcv3/CN/Chongqing-148/2016同源性最高。应用MEGA7.0对pcv3进行ORF2基因的氨基酸序列进行比对发现,第24位至第27位氨基酸存在6种形式,分别为VRRK、ARRR、ARKR、LRRK、VRRR和ARRK。利用MEGA7.0软件中Maximum Likelihood(ML)法p-distance模式构建基于ORF2基因和pcv3全基因的系统发育分析表明,pcv3可分为pcv3a和pcv3b等2种基因型,本试验获得的pcv3/Guangxi-5为pcv3a亚型,其ORF2基因与pcv3/CN/Liaoning-23/2016亲缘关系最近,与NWHEB21、毒株亲缘关系相距最远;其全基因组与CN/Jiangxi-62/2016毒株亲缘关系最近,与CNFJ-1毒株亲缘性最远。结果表明,广西地区犬群普遍存在感染pcv3的情况,理论上丰富了广西地区pcv3的流行病学资料,为pcv3的防治措施的制定和流行病学研究提供一定的参考依据。

关键词： pcv3 犬进化分析

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