猪流行性腹泻病毒S1蛋白的原核表达及其核酸适配体筛选

作     者：张冬萱 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张超

授予年度：2024年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪流行性腹泻病毒 S1-CTD蛋白 原核表达 核酸适配 亲和力 

摘      要：猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪肠道传染性疾病,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。由于PEDV毒株变异系数大,市场现有的灭活疫苗或减毒疫苗并不能够提供足够保护,因此,PEDV早期的诊断及防治药物的开发具有重要意义。 PEDV S蛋白通过与细胞上的受体结合介导病毒进入并发生感染,通常与细胞趋向性和毒力的变化相关。PEDV S蛋白包括S1亚基和S2亚基,其中S1亚基包含信号肽(SP)、N端结构域(NTD)、C端结构域(CTD)、亚结构域1(SD1)和亚结构域2(SD2),已有研究证实PEDV的S1-CTD区域能够与猪氨基肽酶N(p APN)的外结构域产生相互作用。在变体PEDV中,S1-CTD结构域比S1-NTD结构域更保守。因此本研究以S1-CTD为靶标筛选核酸适配体。 核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从人工合成的寡核苷酸文库中筛选出的能与靶标高特异性、高亲和力结合的DNA或RNA小片段单链,也被称为化学抗体,由于核酸适配体合成周期短、易于修饰、靶物质范围广,因此在病毒检测和抗病毒治疗中具有广阔的应用前景。 本试验将公司合成的PEDV-S1-CTD质粒分别与带有MBP、SUMO、Nus A、GST的原核表达载体p ET21b通过T4酶进行连接,构建重组质粒p ET21b-MBP-S1、p ET21b-SUMO-S1、p ET21b-Nus A-S1、p ET21b-GST-S1,经双酶切鉴定和测序鉴定正确后转入原核表达菌株大肠杆菌BL21,诱导表达并分析四种标签重组蛋白的可溶性,综合考虑后选择重组MBP-S1蛋白进行后续实验,纯化后的MBP-S1蛋白经Western blot鉴定其正确表达,间接免疫荧光(IFA)鉴定其能与细胞结合具有生物活性,可用于后续实验。随后经磁珠法通过15轮筛选得到111条针对靶标蛋白的候选适配体序列,其中Apt-S1-3、Apt-S1-11富集程度最高,分别是18%和16.2%,合成Biotin修饰的Apt-S1-3和Apt-S1-11序列,经酶联适配体吸附试验ELASA(Enzyme-Linked aptamer sorbent Assays ELASA)测定得到适配体Apt-S1-3解离常数为2.09n M且不与MBP蛋白、MBP-g D蛋白、MBP-GP5蛋白和BSA蛋白发生交叉反应,具有高亲和力与高特异性。此外,使用在线软件Mfold预测适配体Apt-S1-3d的二级结构,结果显示Apt-S1-3具有环状、发卡结构等能与靶标蛋白特异性结合的基本结构。通过分子对接模拟,发现受体蛋白和适配体Apt-S1-3直接形成了多组相互作用力,如靶标蛋白的ARG207、GLN206与核酸适配体形成了氢键,在这些相互作用力的作用下,适配体能够与靶标蛋白形成结合紧密的复合物,进而发挥生物学功能。最后利用间接免疫荧光和流式细胞术验证该适配体能够识别PEDV病毒并对其感染起抑制作用。该适配体表现出与猪流行性腹泻S1-CTD蛋白的高亲和力高特异性结合及其对猪流行性腹泻病毒的抑制作用,为猪流行性腹泻靶向治疗药物的开发以及检测方法的建立打下基础。