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猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立及初步应用

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 413-418页

作者：周建浩王东方刘影王淑娟马震原谢彩华赵雪丽杨海波冯桂丹康台生胡煜锋李博文闫若潜河南农业大学动物医学院郑州450046 河南省动物疫病预防控制中心/河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室郑州450008 河南科技大学动物科技学院洛阳471000 上海市动物疫病预防控制中心上海201103

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异... 详细信息

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异性引物对和探针;通过对反应体系和反应条件的优化,成功建立了可用于检测PEDV的荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR)方法,将自行建立的FQ-PCR方法的引物对/探针用来确定ddPCR方法;对ddPCR方法进行敏感性、特异性、重复性和初步应用试验。结果显示:自行建立的FQ-PCR方法在敏感性、重复性等方面均优于行标FQ-PCR方法;根据自行设计的FQ-PCR方法建立的ddPCR方法最低检测极限为0.15 copies·μL^(-1),敏感性高于行业标准(SN/T 1699—2017)FQ-PCR方法(1.0×10^(1)copies·μL^(-1));模板浓度为1.0×10^(0)~1.0×10^(4)copies·μL^(-1)时,具有良好的线性关系(R 2>0.99);批内、批间变异系数(CV%)为1.52%~7.40%;对猪丁型冠状病毒、猪伪狂犬病毒等11种对照病毒核酸检测结果均为阴性;分别用建立的ddPCR方法、行业标准FQ-PCR方法对150份临床样品进行PEDV核酸检测,ddPCR方法对行业标准FQ-PCR方法检测阳性样品的检测符合率为10^(0)%。本研究成功建立的PEDV ddPCR检测方法可用于临床上PEDV感染的早期检测和定量检测,为PEDV核酸标准物质的研制提供了定量手段。

关键词：猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR 方法建立

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猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及其单克隆抗体制备

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 181-187页

作者：邱永辉周建卫王潇宇周琳怡侯磊戴贝凝冯旭飞刘爵福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福州350028 扬州大学兽医学院扬州225000

本研究以猪流行性腹泻病毒(PEDV)全基因组为模板,利用RT-PCR方法扩增PEDV S基因的亲水区,将其克隆至pMAl-c2E原核表达载体,获得重组质粒pMAl-c2E-PEDV-S。经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切测序鉴定后,转化BL21菌,经IPTG诱导,成功表达了约74 kDa的... 详细信息

本研究以猪流行性腹泻病毒(PEDV)全基因组为模板,利用RT-PCR方法扩增PEDV S基因的亲水区,将其克隆至pMAl-c2E原核表达载体,获得重组质粒pMAl-c2E-PEDV-S。经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切测序鉴定后,转化BL21菌,经IPTG诱导,成功表达了约74 kDa的重组蛋白MBP-PEDV-S,亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白免疫3只健康的6~8周龄雌性BALB/c小鼠,将小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,获得了4株能稳定分泌抗PEDV S蛋白抗体的杂交瘤细胞株1B11、1B10、1C8、3L3,其腹水效价都高于1∶100000。获得的4株单克隆抗体与PEDV经IFA和Western blot检测,结果显示均具有良好的反应性。而且3株单克隆抗体重链为IgG2a,1株重链为IgG2b;3株轻链为Kappa,1株轻链为Lambda。本研究表达了PEDV S蛋白并制备了单克隆抗体,为研究S蛋白的结构和功能提供了条件,为揭示PEDV致病机制奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S蛋白原核表达单克隆抗体

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猪流行性腹泻病毒S蛋白外分泌信号肽筛选及稳定表达细胞系的构建

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中国兽医科学 2024年第7期 873-880页

作者：王传红宋旭刘诗雨张格格徐红王祎赵永祥郭荣利范宝超胡朝阳李彬江苏大学生命科学学院江苏省农业科学院兽医研究所

为了优化在真核细胞中猪流行性腹泻病毒（PEDV）S蛋白的分泌表达，且构建稳定表达的细胞系，本研究设计合成了9个信号肽引物，通过同源重组的方式得到表达PEDV变异株AH2012/12株S全长蛋白的9个重组表达质粒，瞬时转染HEK 293T细胞后，通... 详细信息

为了优化在真核细胞中猪流行性腹泻病毒（PEDV）S蛋白的分泌表达，且构建稳定表达的细胞系，本研究设计合成了9个信号肽引物，通过同源重组的方式得到表达PEDV变异株AH2012/12株S全长蛋白的9个重组表达质粒，瞬时转染HEK 293T细胞后，通过Western-blot验证蛋白外分泌表达水平，结果显示，筛选出的含跨膜蛋白酶丝氨酸信号肽的S蛋白具有较好的外分泌表达特性；利用G418筛选，获得稳定表达PEDV S蛋白的单克隆细胞，通过传代验证不同代次的蛋白表达水平，成功构建了可稳定外分泌表达PEDV S的CHO细胞系。结果显示，可在100 m L CHO-PEDV/S细胞培养上清中获得约5 mg的PEDV S蛋白，提高了PEDV S蛋白的表达和分泌，为进一步研制PEDV亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S蛋白信号肽稳定表达亚单位疫苗

猪流行性腹泻病毒感染仔猪空肠转录组差异表达分析

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畜牧兽医学报 2024年第6期55卷 2652-2661页

作者：李栋梁郑关民李帅朱洪森吴超河南农业大学动物医学院郑州450046 河南农业大学动物科技学院郑州450046 河南中医药大学医学院郑州450046 郑州海关郑州450008

旨在分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染仔猪空肠组织的转录组差异。用PEDV毒株HB(G2b)感染3头2日龄仔猪,对感染后18 h仔猪空肠组织进行免疫组化、转录组测序和分析,最后采用荧光定量PCR(RT-qPCR)验证转录组结果。结果显示:仔猪感染PEDV 1... 详细信息

旨在分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染仔猪空肠组织的转录组差异。用PEDV毒株HB(G2b)感染3头2日龄仔猪,对感染后18 h仔猪空肠组织进行免疫组化、转录组测序和分析,最后采用荧光定量PCR(RT-qPCR)验证转录组结果。结果显示:仔猪感染PEDV 18 h后空肠绒毛明显脱落、变短,且PEDV主要分布于空肠肠绒毛表面;GO富集及KEGG富集分析的差异基因主要与免疫应答过程和炎症反应过程相关;富集在趋化因子受体相互作用、Toll受体信号、脂肪与糖代谢等。结果提示PEDV感染可激活宿主免疫反应及相关抗病毒信号通路,并且引起宿主的炎症风暴和营养代谢紊乱,为深入研究PEDV的致病机制奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒转录组致病机制

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猪流行性腹泻病毒在规模化抗体阳性猪场的动态传播

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微生物学通报 2024年

作者：亢麒翔胡广利耿瑞王暄慈邝展鹏黄逸晖曾思莹彭欧阳张灏曹永长中山大学生命科学学院

【背景】猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是导致仔猪腹泻的最主要的病原之一。因其发病迅速难以记录，目前尚无关于PEDV感染仔猪后病原在猪场内分布的动态研究报道。【目的】探索PEDV在规模化猪场内的动态... 详细信息

【背景】猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是导致仔猪腹泻的最主要的病原之一。因其发病迅速难以记录，目前尚无关于PEDV感染仔猪后病原在猪场内分布的动态研究报道。【目的】探索PEDV在规模化猪场内的动态传播过程，改进防控PED的策略。【方法】首次模拟了PEDV在封闭的规模化养殖场中感染仔猪后的传播过程，检测了猪群及场内不同区域的病毒丰度。【结果】仔猪肛拭子和空气样品病毒丰度在仔猪感染PEDV初期具有明显的一致性变化，PEDV在场内的传播与员工移动密切相关，并且洗澡间可能是PEDV的重要藏匿点。【结论】猪舍空气的病毒丰度有可能作为PED早期的监测指标，并且员工相关的介质和场地是PEDV生物安全防控的重要对象。本研究为改进猪场针对PED的生物安全防控提供了一定参考，并且为类似病毒在规模化猪场传播的研究工作奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒外环境生物安全防控

猪流行性腹泻病毒分子特征、基因分型及流行现状

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黑龙江畜牧兽医 2024年第7期 1-6页

作者：伊淑帅张易瑞孙晶李博建尹柏双吉林农业科技学院吉林吉林132101 吉林省猪重要疫病防控跨区域合作科技创新中心吉林吉林132101 吉林农业大学长春130118 延边大学吉林延边133002

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起仔猪严重肠道疾病的病原之一,新生仔猪感染后常引起致死性水样腹泻、呕吐、出血性肠炎,死亡率高达100%,给全球养猪业带来了巨大的经济损失。2010年,高致病性PEDV变异毒株... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起仔猪严重肠道疾病的病原之一,新生仔猪感染后常引起致死性水样腹泻、呕吐、出血性肠炎,死亡率高达100%,给全球养猪业带来了巨大的经济损失。2010年,高致病性PEDV变异毒株的出现与流行造成猪流行性腹泻(PED)在全球的再次暴发,以经典毒株为抗原的流行性腹泻疫苗无法有效控制高致病性变异毒株的流行。文章综述了PEDV基因组结构与蛋白功能、基因分型与流行现状,以期为PEDV新型疫苗的研究提供参考。

关键词：猪流行性腹泻病毒基因组蛋白功能基因分型流行现状

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猪流行性腹泻病毒通用实时荧光定量RT-PCR方法的建立与初步应用

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中国兽医科学 2024年

作者：李玮卓林青青刘萍李军蓝李静李娟成晶陈振海陈蕾骆焕东扬州大学动物科学与技术学院泰州蕾灵百奥生物科技有限公司扬州大学兽医学院

以猪流行性腹泻病毒(PEDV)一段保守的M基因序列为靶标，建立可匹配96.93%现有毒株的PEDV实时荧光定量RT-PCR检测方法。优化反应条件后绘制标准曲线，相关系数R2=0.9995，线性关系良好。该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒、猪... 详细信息

以猪流行性腹泻病毒(PEDV)一段保守的M基因序列为靶标，建立可匹配96.93%现有毒株的PEDV实时荧光定量RT-PCR检测方法。优化反应条件后绘制标准曲线，相关系数R2=0.9995，线性关系良好。该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒、猪链球菌、猪圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪丁型冠状病毒无交叉反应，特异性良好。灵敏度和重复性试验结果显示对PEDV的最低检测限为2.10 copies/μL，且批内、批间重复试验的变异系数均小于2%。用该方法与本病原行业标准方法对162份临床样本进行同批对比检测，结果与行业标准方法的阳性符合率为100%。结果表明，本方法特异性、灵敏度、重复性好，能够有效检测病毒GI和GII基因型，能对导致猪群腹泻的PEDV进行早期确诊。

关键词：猪流行性腹泻病毒 M基因实时荧光定量RT-PCR TaqMan探针

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猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白的研究进展

中国动物传染病学报 2024年第3期 200-208页

作者：苏朗驹黄宗洋黄俊张琬玓孙敬帅叶曼青李智丽佛山科学技术学院生命科学与工程学院

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是猪流行性腹泻(PED)的病原，PEDV可导致猪的急性腹泻、脱水甚至死亡。PEDV最早在1971年被报道，如今，它已成为引起仔猪腹泻的最常见病原体之一，对我国养猪行业造成极大的经济损失。核衣壳(N)蛋白是PEDV主要的... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是猪流行性腹泻(PED)的病原，PEDV可导致猪的急性腹泻、脱水甚至死亡。PEDV最早在1971年被报道，如今，它已成为引起仔猪腹泻的最常见病原体之一，对我国养猪行业造成极大的经济损失。核衣壳(N)蛋白是PEDV主要的结构蛋白质之一。本文对PEDV N蛋白的核定位信号、生理功能、与宿主细胞互作和检测方法四个方面的研究进展综述，以期能对N蛋白的了解更够更加深入，并为PED防控提供参考作用。

关键词：猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白核定位宿主细胞检测方法研究进展

猪流行性腹泻病毒变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立及临床应用

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黑龙江畜牧兽医 2024年第7期 18-22,29页

作者：龚婷马辉郭宏伟郑鸣河南牧业经济学院郑州471003

为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的病原学方法和掌握洛阳市PEDV变异毒株的流行规律,试验根据GenBank中PEDV变异毒株的特异性序列设计引物,通过优化退火温度、模板添加量、引物添加量建立PEDV变异毒株一步法RT-... 详细信息

为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的病原学方法和掌握洛阳市PEDV变异毒株的流行规律,试验根据GenBank中PEDV变异毒株的特异性序列设计引物,通过优化退火温度、模板添加量、引物添加量建立PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法,并分析了该方法的特异性、敏感性和重复性;同时应用该方法检测采集自洛阳市的251份临床样品,并对不同地区、不同年份、不同养殖模式的检测结果进行比较分析。结果表明:优化后的退火温度为51℃,模板添加量为5μL,引物添加量为0.5μL;该方法对PEDV变异毒株能够扩增出550 bp特异性条带,而检测的PEDV经典毒株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均为阴性;对PEDV变异毒株RNA的最低检测限达到0.74 ng,对3份PEDV变异毒株阳性病料和3份PEDV变异毒株阴性病料重复检测3次的结果完全一致;检测采集于洛阳市251份临床样品的平均阳性率为29.48%,其中不同地区阳性率介于13.33%~44.44%之间,2018—2022年阳性率介于28.30%~31.58%之间,散养户和规模化猪场的阳性率分别为38.24%和19.13%。说明试验建立的PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法特异、敏感、稳定、准确,洛阳市PEDV变异毒株的流行特点为个别地区较严重的情况、近几年流行率基本持平、散养户流行情况较规模化猪场严重。

关键词：猪流行性腹泻病毒变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法临床应用流行规律

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