基于直接质谱技术探究聚丙烯纳微塑料胁迫下的尼罗罗非鱼代谢响应

作     者：吴小康 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：梁大鹏

授予年度：2024年

学科分类：083002[工学-环境工程] 0830[工学-环境科学与工程（可授工学、理学、农学学位）] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学] 

主      题：聚丙烯纳微塑料 罗非鱼 多组织器官 内部萃取电喷雾电离质谱 非靶向代谢组学 

摘      要：近年来,以纳微塑料为代表的新兴污染物在环境中蓄积所产生的生态毒害作用,已经成为备受关注和影响范围最大的环境问题之一。聚丙烯广泛应用于纺织品、注塑和薄膜等行业,但是在当前对于聚丙烯纳微塑料（polypropylene nano-and microplastics,PP-N/MPs）诱导的代谢毒性效应的研究仍然相对有限。传统的色谱-质谱联用技术已成为环境代谢组学的重要技术手段之一,然而传统的色谱-质谱联用技术需要复杂繁琐的预处理环节,无法满足大批量样品高通量分析的实际需求,而且长时间的样品预处理过程会不可避免地造成代谢组分的流失,将极大影响代谢物信息的准确性。近年来兴起的内部萃取电喷雾电离质谱（internal extractive electrospray ionization mass spectrometry,iEESI-MS）可针对“取、“萃、“测三个不同时空阶段,实现生物组织样品的非破碎、不研磨、无繁杂样品处理的直接质谱分析。本论文基于iEESI-MS技术,建立了尼罗罗非鱼各组织器官中内源性代谢物的直接检测方法,并应用于探究不同粒径与不同浓度下PP-N/MPs对罗非鱼的代谢扰动影响。本论文的主要研究内容如下: （1）基于iEESI-MS技术探究了不同浓度（1、10、100 mg/g）和不同尺寸（100 nm、100μm）的PP-N/MPs对罗非鱼解毒器官肝脏中代谢产物的影响。首先,通过萃取剂优化实验,发现了CH3OH:H2O（80:20,v/v）是适合肝脏组织样品内部小代谢物和脂质类物质萃取的最佳溶剂条件。建立了基于iEESI-MS用于罗非鱼肝脏样品内源性代谢物的非靶向分析方法,并考察了所建立的方法适用于代谢组学的各项指标,日内重复性（CV）测试范围为7.53-14.80%,日间重复性（CV）测试范围为7.39-14.33%,均小于15%,重复性良好。根据测得的质谱数据建立了三维的偏最小二乘法判别分析模型（Partial Least Squares Discriminant Analysis,PLS-DA）,并对数据模型进行了K折交叉验证（K-fold cross-validationk-fold）和显著性检验（Significance test）,准确度范围在0.85-0.99（Accuracy0.8）之间,R2值范围在0.85-0.95（R20.5）之间,Q2值范围在0.80-0.90（Q20.4）之间,显著性水平（Significance level）ρ0.001,数据置信度可达99.9%以上。对肝脏样本进行直接分析,结合高能诱导裂解（Higher energy Collision induced Dissociation,HCD）实验以及串联质谱的商业化标准品验证实验,鉴定了具有重要意义的多种代表性差异成分,包括氨基酸、肽、碳水化合物、生物碱、嘌呤、嘧啶、核苷和磷脂等46种丰富的差异代谢产物种类。多元统计分析结果表明,相较于浓度组而言,粒径组的差异影响更大,从代谢通路和功能性代谢物的上调（或下调）情况分析得出,脂质相关的物质发生了显著下调,表明100 nm粒径的塑料微粒可能进入到了鱼类肝脏组织屏障,促进活性氧（ROS）介导的甘油磷脂降解,最终破坏膜的完整性,流动性和功能。花生四烯酸或类花生四烯酸等物质发生了明显上调,表明100 nm粒径的塑料颗粒可能会诱发鱼类的免疫性肝炎和氧化应激等反应。 （2）基于iEESI-MS技术从整体代谢的角度探究了不同浓度（1、10、100mg/g）和尺寸（100 nm、100μm）的PP-N/MPs对罗非鱼多组织器官中代谢产物的影响以及代谢产物的相关性。通过萃取剂比例的优化实验,发现CH3OH:NH4OH（100:0.3,v/w）是适合鱼脑、鱼鳃和肌肉组织样品内部小代谢物和脂质类物质萃取的最佳溶剂条件。建立了基于iEESI-MS用于罗非鱼各组织器官样品内源性代谢物的非靶向分析方法,考察了所建立方法适用于代谢组学分析的各项指标。交叉验证测试结果表明,R2值大于Q2值,并且Q2回归线的截距为负值,反映了PLS-DA模型的有效性。此外,对R2和Q2进行了1000次置换试验,以防止PLS-DA模型的过度拟合,结果（ρ0.001）,数据置信度可达99.9%以上。分别对鱼脑、鱼鳃和肌肉组织样本进行直接分析,结合能量诱导裂解（Collision-Induced Dissociation,CID）实验以及串联质谱的商业化标准品验证实验,分别鉴定出71、70和60种具有重要意义的多种代表性差异代谢产物,包括氨基酸、肽、肉碱、磷脂酰胆碱、鞘脂、脂肪酸和脂肪醇等。并对各组织器官中特有的差异代谢物和共同代谢物进行了分析,多元统计分析结果表明,与所设定的塑料颗粒的浓度相比,粒径对罗非鱼的代