20（S）-原人参二醇对非小细胞肺癌NCI-H1299细胞生物学行为和基因表达影响的研究

作     者：吕泽旗 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：丛中一

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：非小细胞肺癌 原人参二醇 转录组 ERK1/2 p38 MAPK 

摘      要：研究背景:肺癌严重威胁人类健康,发病率和死亡率分别位列恶性肿瘤发病率、死亡率的第一位,非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是其主要病理类型。早期NSCLC的主要治疗方法是手术切除,辅以放化疗。然而早期NSCLC不易被发现,多数患者确诊时已处于晚期,失去了手术机会。几十年来,晚期NSCLC的治疗方法仅包括具有较强毒副作用的姑息性化疗,患者耐受性差,且长期用药致肿瘤细胞耐药。近年来尽管低毒副作用的靶向治疗和免疫疗法在治疗局部晚期和转移性NSCLC方面表现出较好效果,但其适用患者有限、成本高、耐药等问题限制了广泛应用。多数国家肺癌患者的5年生存率仅为10%至20%,因此开发高效低毒的新型抗肺癌药物,将有助于提高治疗效果,改善预后。人参皂苷是人参的主要活性成分,具有多种生物学作用,包括抗肿瘤作用,其中原人参二醇型皂苷具有较强的抗肿瘤活性。原人参二醇是原人参二醇型皂苷在体内的主要代谢产物,研究表明其抗癌活性比其前体人参皂苷Rh2、Rg3等更强。目前,关于原人参二醇抗肿瘤作用机制的研究有限,通常是针对某种生物过程或某一通路的探讨,尚缺乏较全面的认识。因此,本研究拟采用细胞实验结合转录组测序和生物信息学方法,探讨20（S）-原人参二醇[20（S）-protopanaxadiol,PPD]对NSCLC NCI-H1299细胞生物学行为和基因表达的影响,分析差异基因所在信号通路,并对关键信号通路进行验证,进一步探讨PPD抗肿瘤作用的分子机制。 方法:体外培养人NSCLC细胞,CCK8法检测PPD对细胞增殖活性的影响;流式细胞术检测PPD对细胞周期和细胞凋亡的影响;transwell法检测PPD对细胞迁移和侵袭能力的影响,用Western blot方法检测细胞迁移和侵袭相关蛋白的表达。分别提取PPD处理组和对照组细胞的总RNA,进行转录组测序;用R软件处理和分析测序数据,其中R包Edge R用于差异基因分析,R包cluster Profiler用于京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析;用R包TCGAbiolinks和tidyverse从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）网站下载并处理肺腺癌患者的m RNA表达数据,R包Edge R分析差异基因在肺癌患者中的表达情况;通过基因表达谱交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）网站分析变化基因与肺腺癌患者生存期的关系。最后,用Western blot法验证差异基因所在关键信号通路的相关蛋白表达和磷酸化变化。 结果:CCK8实验结果显示,PPD对肺癌细胞增殖的抑制作用强于人参皂苷Rh2、Rg3和Rc,PPD作用于NCI-H1299细胞24、48和72 h的IC50分别为30.86μg/m L（66.98μM）、25.97μg/m L（56.37μM）和25.61μg/m L（55.58μM）。流式细胞术结果显示PPD显著诱导NCI-H1299细胞凋亡,其处理组细胞线粒体膜电位显著下降,但其对细胞周期无显著影响。迁移和侵袭实验结果表明,PPD处理组迁移和侵袭的细胞数量显著低于对照组,PPD处理组间充质标志物N-Cadherin、ZEB1、Snail、Slug、Vimentin表达下调,上皮标志物E-Cadherin表达上调。转录组测序分析结果显示,PPD处理组NCI-H1299细胞与对照组相比有938个基因转录上调,466个基因转录下调;差异基因KEGG途径富集分析结果表明丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路排在第一位,富集了最多的差异表达基因;富集于该通路的差异表达基因,多数在PPD作用后呈现与肿瘤组织中相反的表达变化,有些PPD下调的基因如HSPA2和EFNA2与肺腺癌患者的生存期相关,低表达的患者生存期长。进一步检测MAPK信号通路三个主要分支的关键蛋白,细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2）、c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）和p38 MAPK的表达和磷酸化变化,结果PPD处理组细胞中ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化显著降低。 结论:PPD能够抑制NCI-H1299细胞增殖,诱导其凋亡,抑制其迁移和侵袭,抑制上皮-间充质转化。其可通过影响细胞肿瘤相关基因表达和调节ERK1/2和p38 MAPK信号通路来发挥作用。