基于HTRF技术的高通量CRBN蛋白配体筛选平台的构建与优化

作     者：董瑞博 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周余来

授予年度：2024年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：CRBN蛋白 HTRF FRET 高通量筛选 沙利度胺结合域 

摘      要：Cereblon（CRBN）是一种E3泛素连接酶,在蛋白降解靶向嵌合体（Proteolysis-targeting chimera,PROTAC）药物发现领域应用十分广泛。目前,多数PROTAC药物都通过CRBN实现目标蛋白的靶向降解。其作用机制是:PROTAC通过其结构中的靶蛋白配体和CRBN配体将靶蛋白和CRBN拉近,形成一个稳定的三元复合物,促使靶蛋白被泛素标记,进而被26S蛋白酶体识别和降解。CRBN沙利度胺结合域（Thalidomide binding domain,TBD）,是以沙利度胺为代表的度胺类CRBN配体的结合位点。CRBN TBD在PROTAC药物诱导形成Protein-PROTAC-CRBN三元复合物的过程中,发挥着不可或缺的作用。因此,针对CRBN TBD的选择性配体的发现具有重要的科学意义。本研究旨在开发一种高通量筛选方法,以期筛选出特异性靶向CRBN TBD的活性配体。 目前,有四种已发表的基于荧光共振能量转移技术的CRBN配体筛选方法。2016年,Boichenko等人将趋磁螺菌中的CRBN亚型4上的两个色氨酸突变为了苯丙氨酸,使得CRBN蛋白自身成为了荧光团,进而与探针分子发生荧光共振能量转移。然而,由于此种方法缺乏时间分辨功能,此方法无法有效降低背景噪音。2020年和2022年相继报道了两种相似的CRBN配体筛选方法,两者均使用了人源CRBN（h CRBN）与DNA损伤结合蛋白1（DDB1）的蛋白复合物,需借助真核表达系统,导致表达纯化复杂、成本高昂。2021年,Taosheng Chen报道了一种能用于筛选同时靶向两种蛋白（CRBN和BRD2 BD1）的PROTAC或分子胶的方法,然而该方法不适用于仅靶向CRBN配体的初筛。本研究在以上的基础上,拟构建一个稳定性好、低成本的高通量筛选平台,以期能够筛选出新的CRBN配体,更有效的测试PROTAC类药物与CRBN的结合力。 本平台为了确保能筛选出特异性靶向TBD的小分子配体,设计合成了His6-h CRBN-TBD质粒。通过大肠杆菌原核系统表达h CRBN-TBD蛋白,通过镍离子亲和层析柱以及凝胶过滤层析对蛋白进行了纯化。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱结果显示,获得了较纯的h CRBN-TBD蛋白。 通过将生物素和沙利度胺以不同的方式连接,设计并合成了三种探针分子。初步均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence,HTRF）测试发现三种探针均有荧光共振能量转移信号,信号强度接近。进一步HTRF测试显示三种探针在200 n M时表现出了最大的信号窗口,适宜进行高通量筛选。当增加了实验时荧光团溶液的浓度时,实验S/B值发生了显著提高（P0.0001）,从3.3增加至5.8。采用蛋白探针的正交实验,确定了蛋白与探针的最佳浓度比为40 n M:200 n M,此时S/B值达到10.9。实验结果表明,HTRF实验信号在6 min后就达到稳定状态,并且在3 h内结果都是稳定的。最终确定的筛选条件为:h CRBN:b Tha02浓度比为40 n M:200 n M,并使用2×荧光团溶液进行实验。随后的实验测试了DMSO对实验结果造成的可能影响,研究发现DMSO浓度需要达到1%以上才具有显著影响。 初筛条件采用20μM的单浓度点筛选,筛选出56种在20μM抑制率超过50%的化合物,其中来那度胺、泊马度胺、沙利度胺被筛选出,在该条件下的抑制率均接近100%。接下来选择了8种化合物在HTRF平台上进行了多浓度点活性测试,测得来那度胺的IC50值为820 n M,其它在单浓度点筛选时测得活性较好的化合物的IC50值都接近来那度胺的IC50值,这验证了单浓度点筛选与多浓度点活性测试结果的一致性。 为全面评估筛选结果的准确性和可靠性,本研究采用了与HTRF结合模式类似的均相光激化学发光筛选（Amplified Luminescence Proximity Homogeneous Assay Screen,Alpha Screen）实验,以及另外一种高通量筛选实验热漂移实验（Thermal shift assay,TSA）进行进一步验证。其中同一化合物在Alpha Screen实验上的IC50值比在HTRF实验上的IC50值大。例如,来那度胺在HTRF上测得IC50值为820 n M,在Alpha Screen实验上测得IC50值为3.9μM。整体看Alpha Screen实验上的结果与HTRF实验上的结果趋势一致,说明搭建的HTRF实验平台是有效的。在TSA实验中,前面筛选出的苗头化合物均有较高的ΔTm值,其中来那度胺的ΔTm值为3℃,而其他活性较差的化合物ΔTm值为0℃左右,再次证明了筛选策略和测试