检索结果-南通市图书馆

作者：董瑞博吉林大学

学位级别：硕士

Cereblon（crbn）是一种E3泛素连接酶,在蛋白降解靶向嵌合体（Proteolysis-targeting chimera,PROTAC）药物发现领域应用十分广泛。目前,多数PROTAC药物都通过crbn实现目标蛋白的靶向降解。其作用机制是:PROTAC通过其结构中的靶蛋白配体... 详细信息

Cereblon（crbn）是一种E3泛素连接酶,在蛋白降解靶向嵌合体（Proteolysis-targeting chimera,PROTAC）药物发现领域应用十分广泛。目前,多数PROTAC药物都通过crbn实现目标蛋白的靶向降解。其作用机制是:PROTAC通过其结构中的靶蛋白配体和crbn配体将靶蛋白和crbn拉近,形成一个稳定的三元复合物,促使靶蛋白被泛素标记,进而被26S蛋白酶体识别和降解。crbn沙利度胺结合域（Thalidomide binding domain,TBD）,是以沙利度胺为代表的度胺类crbn配体的结合位点。crbn TBD在PROTAC药物诱导形成Protein-PROTAC-crbn三元复合物的过程中,发挥着不可或缺的作用。因此,针对crbn TBD的选择性配体的发现具有重要的科学意义。本研究旨在开发一种高通量筛选方法,以期筛选出特异性靶向crbn TBD的活性配体。目前,有四种已发表的基于荧光共振能量转移技术的crbn配体筛选方法。2016年,Boichenko等人将趋磁螺菌中的crbn亚型4上的两个色氨酸突变为了苯丙氨酸,使得crbn蛋白自身成为了荧光团,进而与探针分子发生荧光共振能量转移。然而,由于此种方法缺乏时间分辨功能,此方法无法有效降低背景噪音。2020年和2022年相继报道了两种相似的crbn配体筛选方法,两者均使用了人源crbn（h crbn）与DNA损伤结合蛋白1（DDB1）的蛋白复合物,需借助真核表达系统,导致表达纯化复杂、成本高昂。2021年,Taosheng Chen报道了一种能用于筛选同时靶向两种蛋白（crbn和BRD2 BD1）的PROTAC或分子胶的方法,然而该方法不适用于仅靶向crbn配体的初筛。本研究在以上的基础上,拟构建一个稳定性好、低成本的高通量筛选平台,以期能够筛选出新的crbn配体,更有效的测试PROTAC类药物与crbn的结合力。本平台为了确保能筛选出特异性靶向TBD的小分子配体,设计合成了His6-h crbn-TBD质粒。通过大肠杆菌原核系统表达h crbn-TBD蛋白,通过镍离子亲和层析柱以及凝胶过滤层析对蛋白进行了纯化。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱结果显示,获得了较纯的h crbn-TBD蛋白。通过将生物素和沙利度胺以不同的方式连接,设计并合成了三种探针分子。初步均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence,HTRF）测试发现三种探针均有荧光共振能量转移信号,信号强度接近。进一步HTRF测试显示三种探针在200 n M时表现出了最大的信号窗口,适宜进行高通量筛选。当增加了实验时荧光团溶液的浓度时,实验S/B值发生了显著提高（P蛋白探针的正交实验,确定了蛋白与探针的最佳浓度比为40 n M:200 n M,此时S/B值达到10.9。实验结果表明,HTRF实验信号在6 min后就达到稳定状态,并且在3 h内结果都是稳定的。最终确定的筛选条件为:h crbn:b Tha02浓度比为40 n M:200 n M,并使用2×荧光团溶液进行实验。随后的实验测试了DMSO对实验结果造成的可能影响,研究发现DMSO浓度需要达到1%以上才具有显著影响。初筛条件采用20μM的单浓度点筛选,筛选出56种在20μM抑制率超过50%的化合物,其中来那度胺、泊马度胺、沙利度胺被筛选出,在该条件下的抑制率均接近100%。接下来选择了8种化合物在HTRF平台上进行了多浓度点活性测试,测得来那度胺的IC50值为820 n M,其它在单浓度点筛选时测得活性较好的化合物的IC50值都接近来那度胺的IC50值,这验证了单浓度点筛选与多浓度点活性测试结果的一致性。为全面评估筛选结果的准确性和可靠性,本研究采用了与HTRF结合模式类似的均相光激化学发光筛选（Amplified Luminescence Proximity Homogeneous Assay Screen,Alpha Screen）实验,以及另外一种高通量筛选实验热漂移实验（Thermal shift assay,TSA）进行进一步验证。其中同一化合物在Alpha Screen实验上的IC50值比在HTRF实验上的IC50值大。例如,来那度胺在HTRF上测得IC50值为820 n M,在Alpha Screen实验上测得IC50值为3.9μM。整体看Alpha Screen实验上的结果与HTRF实验上的结果趋势一致,说明搭建的HTRF实验平台是有效的。在TSA实验中,前面筛选出的苗头化合物均有较高的ΔTm值,其中来那度胺的ΔTm值为3℃,而其他活性较差的化合物ΔTm值为0℃左右,再次证明了筛选策略和测试

关键词： crbn蛋白 HTRF FRET 高通量筛选沙利度胺结合域

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沙利度胺及黄芩素对HEL细胞增殖、凋亡及crbn蛋白表达的影响

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徐州医科大学学报 2017年第9期37卷 566-570页

作者：颜静秀赵利东徐州医科大学附属连云港医院血液科江苏连云港222000

目的观察沙利度胺、黄芩素单用及联合应用对人红白血病（HEL）细胞的增殖、凋亡及crbn（eere-blon）蛋白表达水平的影响。方法沙利度胺组、黄芩素组、沙利度胺＋黄芩素组（联合组）作用于HEL细胞48h，用CCK8法检测细胞的增殖抑制率，流... 详细信息

目的观察沙利度胺、黄芩素单用及联合应用对人红白血病（HEL）细胞的增殖、凋亡及crbn（eere-blon）蛋白表达水平的影响。方法沙利度胺组、黄芩素组、沙利度胺＋黄芩素组（联合组）作用于HEL细胞48h，用CCK8法检测细胞的增殖抑制率，流式细胞仪双染法检测细胞的凋亡率，Westernblot检测细胞crbn蛋白的表达水平。结果沙利度胺与黄芩素单用及联合应用均可抑制HEL细胞的增殖，与药物浓度均呈正相关（r=0．991、r=0．989、r=0．993，P〈0．01）；3组药物均可诱导HEL细胞凋亡，与药物浓度均呈正相关（r=0．887、r=0．921、r=0．934，P〈0．01）；且沙利度胺与黄芩素联合应用的增殖抑制作用和促凋亡作用比单用沙利度胺、黄芩素明显增强，差异均有统计学意义（P〈0．05）。沙利度胺处理HEL细胞48h降低crbn蛋白表达，与药物浓度呈负相关（r=-0．975，P〈0．01）；黄芩素处理HEL细胞48h诱导crbn蛋白表达，与药物浓度呈正相关（r=0．973，P〈0．01）。结论沙利度胺联合黄芩素呈剂量依赖性抑制HEL细胞增殖并诱导凋亡，比单用沙利度胺、黄芩素的作用明显增强，其机制可能与黄芩素上调crbn蛋白的表达而增强HEL细胞对沙利度胺的敏感性有关。

关键词：沙利度胺黄芩素人红白血病细胞增殖凋亡 crbn蛋白

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来那度胺对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226 Cereblon表达水平的影响

来那度胺对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226 Cereblon表达水平的影响

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作者：杨东雅河北医科大学

学位级别：硕士

目的：Cereblon（crbn）是广泛表达E3连接酶的蛋白，其介导来那度胺在骨髓瘤细胞发挥抗增殖活性，并诱导T细胞产生细胞因子。研究发现来那度胺的抗骨髓瘤活性需要Cereblon的表达，对crbn蛋白功能有抑制作用，且crbn是来那度胺治疗多发... 详细信息

目的：Cereblon（crbn）是广泛表达E3连接酶的蛋白，其介导来那度胺在骨髓瘤细胞发挥抗增殖活性，并诱导T细胞产生细胞因子。研究发现来那度胺的抗骨髓瘤活性需要Cereblon的表达，对crbn蛋白功能有抑制作用，且crbn是来那度胺治疗多发性骨髓瘤重要的分子靶点。本实验旨在研究免疫调节剂来那度胺及蛋白酶体抑制剂硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡及Cereblon表达水平的影响。1观察免疫调节剂来那度胺及蛋白酶体抑制剂硼替佐米抑制骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖的作用。2检测免疫调节剂来那度胺及蛋白酶体抑制剂硼替佐米对骨髓瘤细胞株RPMI8226诱导凋亡的作用。3观察分析免疫调节剂来那度胺及蛋白酶体抑制剂硼替佐米对骨髓瘤细胞株RPMI8226Cereblon（crbn）基因表达的影响。4观察分析免疫调节剂来那度胺及蛋白酶体抑制剂硼替佐米对骨髓瘤细胞株RPMI8226Cereblon（crbn）蛋白表达的影响。方法：1首先选取人骨髓瘤细胞株RPMI8226为研究对象，用CCK8比色法检测来那度胺及硼替佐米对骨髓瘤细胞RPMI8226增殖的抑制作用。2应用流式细胞术检测来那度胺及硼替佐米诱导骨髓瘤细胞RPMI8226凋亡的作用;3应用实时荧光定量PCR方法检测来那度胺及硼替佐米对骨髓瘤细胞RPMI8226crbn基因表达的影响。4应用Western Blot方法检测来那度胺及硼替佐米对骨髓瘤细胞RPMI8226crbn蛋白表达的影响。5实验分组如下：（1）空白对照组：不加入任何药物，即来那度胺浓度为0nmol/L;（2）来那度胺干预组：预实验中分别以200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L浓度干预细胞24h、48h、72h,检测结果以干预24h后最理想，而干预48h,72h后细胞凋亡偏多，故下述实验均以干预24h为主，来检测来那度胺对RPMI8226细胞的增殖抑制作用。（3）硼替佐米干预组：以10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L浓度分别干预细胞24h，来检测硼替佐米对RPMI8226细胞的增殖抑制作用。6实验分组如下：（1）空白对照组：不加入任何药物，即来那度胺浓度为0nmol/L;（2）来那度胺干预组：以200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L浓度的来那度胺分别干预细胞24h，来检测来那度胺对骨髓瘤细胞RPMI8226的促凋亡作用。（3）硼替佐米干预组：以10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L浓度硼替佐米分别干预细胞24h，来检测硼替佐米对骨髓瘤细胞RPMI8226的促凋亡作用。7实时荧光定量PCR检测上述不同浓度来那度胺及硼替佐米对RPMI8226细胞的crbn基因表达水平的影响。8Western Blot检测上述不同浓度来那度胺及硼替佐米对RPMI8226细胞的crbn蛋白表达水平的影响。9应用SPSS13.0统计软件，方差分析方法处理数据。所有数据用3次独立实验的平均值表示，实验结果用均数±标准差（X±S）表示;P<0.05有统计学意义。结果：1来那度胺及硼替佐米作用于RPMI8226细胞均可以抑制其增殖。（1）分别以200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L浓度的来那度胺干预细胞24h;各组抑制率分别为（16.67±0.25）%、（26.35±1.21）%、（36.26±1.03）%，呈剂量依赖性，药物作用浓度越高，抑制率越高，抑制作用越明显，有统计学意义(P=0.00)(Fig.1，Table1)。（2）分别以10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L浓度的硼替佐米干预细胞24h;各组抑制率分别为（8.13±1.14）%、（18.46±0.21）%、（31.43±1.64）%;呈剂量依赖性，药物作用浓度越高，抑制率越高，抑制作用越明显，有统计学意义(P=0.00)(Fig.2，Table2)。2来那度胺及硼替佐米对RPMI8226细胞的促凋亡作用。流式细胞术检测结果显示：（1）分别以0nmol/L、200nmol/L、800nmol/L、3200nmol/L来那度胺干预细胞24h，各组凋亡率分别为（7.12±0.59）%、（17.89±0.31）%、(29.4±0.71)%、(40.33±1.25)%，呈剂量依赖性，药物作用浓度越高，凋亡率越高，促凋亡作用越明显，有统计学意义(P=0.00)（Fig.3，Fig.5，Table3）。（2）分别以0nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L硼替佐米干预细胞24h，各组凋亡率分别为（7.82±0.33）%、（14.26±0

关键词：免疫调节剂来那度胺蛋白酶体抑制剂硼替佐米 RPMI8226细胞株 crbn基因 crbn蛋白

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多发性骨髓瘤免疫调节药物耐药的机制及应对策略研究进展

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山东医药 2023年第20期63卷 111-115页

作者：段圆圆李子坚兰州大学第一临床医学院兰州730000 兰州大学第一医院血液科

免疫调节药物作为多发性骨髓瘤治疗方案中的常用药,其耐药性的发生与crbn表达下调或基因改变、CRL4及Ikaros家族锌指蛋白1/3突变、表观遗传改变、信号通路失调、转运蛋白及RUNX表达异常等多种机制相关。患者发生耐药后容易变得复发难治... 详细信息

免疫调节药物作为多发性骨髓瘤治疗方案中的常用药,其耐药性的发生与crbn表达下调或基因改变、CRL4及Ikaros家族锌指蛋白1/3突变、表观遗传改变、信号通路失调、转运蛋白及RUNX表达异常等多种机制相关。患者发生耐药后容易变得复发难治,病情加速进展。新一代免疫调节药物、蛋白降解靶向嵌合体及表观遗传疗法等针对免疫调节药物耐药的新型治疗方法相继开发,有望改善多发性骨髓瘤患者的临床结局。然而,免疫调节药物耐药机制及逆转耐药的策略研究主要处于细胞实验水平或早期临床试验阶段,未来还需要在大样本量患者中进行全面评估。

关键词：免疫调节药物肿瘤耐药多发性骨髓瘤 crbn蛋白蛋白降解靶向嵌合体表观遗传疗法

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