真菌质膜及其衍生物的功能核酸探针构建及传感应用

作     者：米旭君 

作者单位：中南林业科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：石沐玲;刘高强

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 080202[工学-机械电子工程] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0802[工学-机械工程] 

主      题：灵芝 白色念珠菌 质膜 功能核酸探针 生物传感 

摘      要：真菌质膜和其衍生物细胞外囊泡能够反映真菌的生理和功能状态,在细胞间的物质运输和信息通讯中发挥重要功能,是目前研究的热点问题之一。近年来兴起的膜表面工程技术,能在质膜和细胞外囊泡膜表面进行修饰,实现功能改造和行为控制,引起了众多研究者的关注。膜表面工程技术常用的共价共轭,静电相互作用、化学修饰等方法存在严重的生物相容性问题,还会对生物活性有所影响。而由核酸或类核酸分子组成的功能核酸探针有良好的生物相容性和极低的毒性,能够识别并感知所测样品中的目标物,并转换为电信号或者光信号表达出来。在此背景下,本论文主要构建了合成相对简单,成本低,稳定性好的功能核酸探针,并将其用于真菌质膜和细胞外囊泡的锚定与标记中,为搭建真菌质膜和细胞外囊泡通用的锚定核酸探针平台打下基础。主要研究结果如下:1.灵芝质膜的功能核酸探针构建及传感应用本章设计并合成一种能锚定和标记灵芝质膜的TAMRA全氟化碳核酸探针(TAMRA perfluorocarbon nucleic acid probe,TPFN),用于监测灵芝原生质体细胞壁再生过程。首先制备了灵芝原生质体;引入全氟化碳链,采用固相合成法合成TPFN功能核酸探针,核磁共振和质谱鉴定手段证明TPFN制备成功,测得其激发波长为560 nm,发射波长范围为575-700 nm;通过流式细胞仪检测到TPFN能够锚定到原生质体上,激发出很强的TAMRA荧光,检测TPFN探针与灵芝原生质体及灵芝长壁细胞的孵育情况,结果显示TPFN探针只能锚定灵芝原生质体质膜,由此证明TPFN探针锚定灵芝原生质体质膜具有可行性和特异性;利用TPFN探针对原生质体生长细胞壁的过程进行监测,测定了 TPFN对生长0,12,24,36,48,60 h原生质体的锚定情况,结果表明,随着培养时间的增加,灵芝细胞壁逐渐生长,暴露的质膜也逐渐减少,导致TPFN探针能够结合到的灵芝原生质体数量减少,分别对应61.5%,32.4%,30.4%,25.9%,7.25%和0.031%,扫描电镜的结果也证实了细胞壁的生长过程。因此可将该探针作为监测灵芝细胞壁生长的一种新型工具。2.白色念珠菌质膜及其衍生物的功能核酸探针构建及传感应用本章合成了一种能锚定和标记在白色念珠菌质膜上的四面体DNA纳米结构(Tetrahedral DNA Nanostructure,TDN),用于监测白色念珠菌分泌的细胞外囊泡。为了得到去壁完整的白色念珠菌原生质体,制备了白色念珠菌原生质体并优化了去壁条件,确定最佳条件为添加7.5%β-巯基乙醇量(V/V),计算值2倍的2%的蜗牛酶量,酶解3小时;将疏水分子胆固醇与DNA四面体纳米结构结合,合成TDN探针,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳证明TDN核酸探针制备成功,采用荧光分光光度计测得其激发波长为479 nm,发射波长范围为507-600 nm;通过流式细胞仪检测,确定TDN探针能够结合到白色念珠菌原生质体上,激发出较强的FAM荧光,由此证明TDN探针锚定白色念珠菌原生质体具有可行性;比较了 TDN与白色念珠菌原生质体及白色念珠菌菌体的孵育情况,结果显示TDN探针与白色念珠菌原生质体结合具有更高的荧光强度,由此证明TDN探针锚定白色念珠菌原生质体具有特异性;且与胆固醇数量少的探针比较,TDN探针与质膜结合时荧光最强,具有高稳定性。通过排阻色谱法成功提取出白色念珠菌细胞外囊泡,并利用Exo-spin试剂盒对其进行纯化。此外,通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、质谱鉴定方法表征细胞外囊泡。利用磁珠将白色念珠菌细胞外囊泡富集,达到流式细胞仪检测限,利用TDN探针对其监测,结果表明,TDN探针能够作为监测细胞外囊泡的工具,且两者结合时能保持较高的荧光强度,有更强的结合力。本论文构建了两种功能核酸探针,能对真菌质膜及其衍生物细胞外囊泡进行锚定标记和监测。TPFN探针能锚定于灵芝原生质体,并能作为一种新型工具监测灵芝细胞壁的生长过程,为分子探针用于真菌领域提供一种新思路。TDN探针能锚定并标记白色念珠菌原生质体,并监测白色念珠菌的细胞外囊泡,为后续设计分子探针识别真菌质膜和细胞外囊泡提供依据。