破伤风毒素rTTc蛋白的表达和免疫原性研究

作     者：吴惠宇 

作者单位：长春工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴丛梅

授予年度：2024年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：原核表达 破伤风毒素C片段 分子伴侣 佐剂 

摘      要：破伤风(Tetanus)是由破伤风梭菌在厌氧环境中所产生的一种急性、致死性的神经疾病。破伤风类毒素是破伤风毒素经过0.4%甲醛灭活,精制所制成的疫苗。但破伤风类毒素免疫周期长、接种次数多、接种副反应多,并且在精制的过程中可能会造成环境污染,在灭活的过程中也可能会发生毒性逆转。重组破伤风毒素C片段(rTTC)是破伤风疫苗的一个新的研究方向。 目前rTTC的主要使用大肠杆菌表达体系进行表达,但使用大肠杆菌表达体系进行表达容易形成包涵体,这对蛋白产量,纯化都造成了影响。rTTC为亚单位疫苗,免疫动物时免疫原性较低,必须加以佐剂进行免疫。本文主要从提高rTTC在大肠杆菌可溶性表达量与选择合适佐剂进行免疫以提高药物的免疫原性进行研究。 通过NCBI查找破伤风毒素C片段基因序列(Gene Bank:AF154828.1),将破伤风毒素C片段进行大肠杆菌密码子偏好性优化,构建载体pET30a-HC。将pET30a-HC分别与四种分子伴侣p KJE7、p KJE8、p Gro7、p Tf16共转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。通过SDS-PAGE确定可溶性表达量最高的pET30a-HC与分子伴侣p Gro7共表达菌株。通过对诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间进行单因素实验,确定rTTC在IPTG浓度为0.5m M、L-阿拉伯糖浓度为2mg/m L、诱导温度为25℃、诱导时间为12h时,rTTC可溶性表达量达到最大值。薄层扫描分析仪器显示,目的蛋白的可溶性表达量占总可溶性蛋白表达量的42%。WB实验结果显示,该重组蛋白为rTTC。经镍柱纯化、透析、浓缩处理,成功得到浓缩后的rTTC蛋白。 分别将rTTC免疫辅以铝佐剂、CpG佐剂对小鼠进行粘膜免疫和皮下免疫。对小鼠进行三次免疫,采用Prime-1st boost-2nd boost免疫策略,在第42d处死小鼠。采用粘膜免疫小鼠肺泡灌洗液中无Ig A抗体,其中无特异性Ig G抗体。皮下免疫小鼠血清中均产生高水平的特异性Ig G抗体。在以rTTC作为包被原,HC组、HC+Al组、HC+CpG组的抗体滴度分别为1.02×10～4、2.32×10～4、1.6×10～5。为了确定不同包被原对ELISA效果的影响,分别使用破伤风类毒素、破伤风毒素C片段分别作为包被原进行包被,结果显示抗体滴度无显著性差异。通过IL-4、IFN-γ细胞因子水平测定结果,各个免疫组均产生高水平细胞因子水平,其中HC+CpG组的IL-4、IFN-γ细胞因子水平与其他免疫组均有显著性差异(P0.05,P0.01)。抗体分型结果显示,各个免疫组均产生较为平衡的细胞免疫与体液免疫应答。组织学HE染色结果表明,小鼠的心、肝、脾、肺、肾并没有明显的病变,各个组织脏器并没有受到明显的损伤,该疫苗是安全的。 本论文通过四种分子伴侣与rTTC共表达分析,确定可溶性表达率最高的是pET30a-HC与分子伴侣p Gro7共表达菌株。选择Al佐剂与CpG佐剂探索免疫原性最好的佐剂与rTTC组合,通过皮下免疫与黏膜免疫两种方式对小鼠进行免疫,并对其进行免疫评价。确定rTTC在与CpG佐剂共同使用时具有更高的免疫原性。对rTTC的可溶性与免疫原性进行了初步的探索,为破伤风毒素C片段疫苗的制备提供了新的思路。