新型鹅星状病毒Cap蛋白单抗制备、抗原表位分析及鹅胚传代毒株的致病性研究

作     者：代格 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：薛峰;赵冬敏

授予年度：2022年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：新型鹅星状病毒 Cap蛋白 原核表达 单克隆抗体 致病性 

摘      要：新型鹅星状病毒近年来在我国养鹅地区大面积流行,成为危害我国养鹅业的重要病原之一。本研究以原核表达的新型鹅星状病毒Cap蛋白为免疫原制备单克隆抗体,并分析出其抗原表位,为今后新型鹅星状病毒快速诊断试剂的研发、新型鹅星状病毒Cap蛋白结构与功能的研究和基因工程抗体的研发提供理论支撑。此外,通过动物实验比较分析了在鹅胚上传代的不同代次新型鹅星状病毒的致病性,为进一步深入研究新型鹅星状病毒的毒力与致病特点,以及选育弱毒株用于疫苗开发奠定了基础。 1、新型鹅星状病毒Cap蛋白的原核表达 为了表达新型鹅星状病毒Cap蛋白,采用PCR方法扩增获得新型鹅星状病毒ORF2,构建p ET-28a-ORF2重组质粒,经菌液PCR和质粒双酶切鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,分别进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定。试验结果表明,PCR扩增得到约2000bp的目的片段,与预期相符。重组菌经IPTG诱导在100KDa处出现目的蛋白,且IPTG浓度为2m M、诱导表达6h时目的蛋白的表达量达到高峰。经超声破碎的上清和沉淀的SDS-PAGE分析,重组蛋白以包涵体形式表达。Western Blot结果表明,重组蛋白能够跟His-tag抗体产生特异性结合,说明重组蛋白表达正确,有一定免疫学活性。 2、新型鹅星状病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 以原核表达的Cap蛋白为免疫原,免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠,将免疫后血清效价为阳性的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合。三次亚克隆后筛选出一株稳定分泌抗新型鹅星状病毒Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名1D7,用腹水法大量制备单克隆抗体效价可达1:64000。单克隆抗体亚型鉴定显示1D7亚型为Ig M。Western Blot鉴定表明该单抗可与新型鹅星状病毒发生特异性反应。中和试验结果显示该单抗有一定中和活性。设计特异性引物扩增该单抗抗原结合域,测序后利用蛋白分析软件分析抗原结合域的各功能区。采用截短肽段表达的方法,鉴定出Cap蛋白中该单抗的抗原表位为QKVY。本研究为今后新型鹅星状病毒快速诊断试剂的研发新型鹅星状病毒Cap蛋白结构与功能的研究和基因工程抗体的开发提供了理论依据。 3、鹅胚传代对新型鹅星状病毒致病性的影响 新型鹅星状病毒感染是近年来新发的禽类传染病,幼龄雏鹅极易感染。感染该病毒的幼鹅死亡率可达40%以上,对我国养鹅业造成冲击。为进一步研究新型鹅星状病毒致病性,本研究将实验室保存的新型鹅星状病毒AHQJ18株,在鹅胚上连续传代三次,采用终点稀释法测定病毒TCID。结果发现,第三代鹅胚组织毒效价10TCID/0.15m L,较第一代10TCID/0.15m L有明显下降。基于1日龄雏鹅的攻毒感染实验证实,两代鹅胚组织毒感染的雏鹅表现出相似的临床症状和排毒规律,在剖检病变、组织病理变化和免疫组化分析的结果上也较为一致。但在致死率与限制体重增长方面,第一代鹅胚组织毒强于第三代鹅胚组织毒。本研究比较分析了不同代次新型鹅星状病毒的致病性,为进一步深入研究新型鹅星状病毒的毒力与致病特点,以及选育弱毒株用于疫苗开发奠定了基础。