IBV在鸡巨噬细胞和树突状细胞中复制机制的研究及其对病毒传播的影响

作     者：左金娇 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：林建

授予年度：2022年

学科分类：090602[农学-预防兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：RNA干扰 IBV 病毒来源的siRNA 复制 巨噬细胞 树突状细胞 

摘      要：鸡传染性支气管炎(Avian Infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV属于单股正链RNA病毒,由于RNA病毒容易突变和重组,传统的疫苗防控和抗病毒药物并不能对鸡起到良好的保护效果,因此急需寻找新的预防IBV的有效方法。RNA干扰在植物和无脊椎动物中可以高效地抑制和阻断RNA病毒的复制,但其在鸡中能否有效抑制IBV的复制尚不清楚。因此本研究拟对IBV调控鸡细胞RNA干扰体系影响其自身复制的分子机制进行深入研究。首先,本研究比较了两种IBV毒株(M41和QX)在鸡巨噬细胞和树突状细胞中的复制水平,结果表明仅有QX亚型毒株可以在两种细胞中保持低水平的复制。其次,我们通过小RNA测序发现M41亚型毒株感染两种细胞后产生大量的病毒来源的siRNA,而QX亚型毒株感染后则仅产生少量的病毒来源的siRNA,这可能是QX亚型毒株能在两种细胞中复制的原因。再次,我们的研究发现QX亚型毒株可能是通过抑制两种细胞中Dicer和Ago2的表达进而阻断病毒来源的siRNA的生成,而M41亚型毒株感染并未抑制Dicer和Ago2的表达。最后,我们的研究发现QX亚型毒株可以感染鸡血液中的巨噬细胞进而传播到气管、腺胃以及肾脏,而M41亚型毒株则只能感染和聚集在气管和肺脏。综上,我们的研究既在细胞水平上阐明了IBV调控细胞RNA干扰抑制病毒复制的分子机制,又在动物水平上证实了IBV可以通过感染巨噬细胞传播到全身各处。本研究具体内容分为以下三个部分: ***调控鸡巨噬细胞RNA干扰影响病毒复制分子机制的研究 本研究分离纯化了鸡外周血液来源的巨噬细胞,将QX及M41亚型的病毒分别接种至巨噬细胞。首先病毒复制研究结果表明只有QX亚型毒株可以在巨噬细胞中维持低水平的复制。其次,干扰素相关基因的检测结果表明Ⅰ型和Ⅱ型IFN的上调并不能阻止QX亚型毒株在巨噬细胞中的复制。再次,我们通过高通量测序发现M41亚型毒株感染巨噬细胞后不仅产生更多数量的病毒来源的siRNA,而且siRNA(21-23 nt)的读数比QX亚型毒株感染后的更丰富。最后,荧光定量及Western blot结果均表明QX亚型毒株感染巨噬细胞后通过抑制Dicer和Ago2的表达,进而阻断了病毒来源的siRNA的生成,并促进了病毒在巨噬细胞中的复制。综上,本研究证明了QX及M41亚型的病毒通过影响RNA干扰系统中Dicer和Ago2的表达进而生成不同数量的病毒来源的siRNA,最终导致了两种病毒在巨噬细胞中复制的差异。 ***调控鸡树突状细胞RNA干扰影响病毒复制分子机制的研究 树突状细胞作为专职的抗原递呈细胞,是先天性免疫和适应性免疫之间的桥梁,并且病毒通过利用DCs迁移的特性,从而实现自身的复制和传播。本研究继续通过DCs来探究IBV调控鸡细胞的RNA干扰来影响自身复制的机制。首先病毒复制研究结果表明QX亚型毒株可以在DCs中持续复制,而M41亚型毒株的复制水平则是不断递减的。其次,虽然I型干扰素在QX亚型毒株感染期间显著增加,但却未能抑制病毒在DCs中的复制。再次,我们继续利用高通量测序手段探究IBV感染后树突状细胞中mi RNA、lnc RNA和siRNA的变化。测序结果表明虽然两种病毒刺激DCs后产生病毒来源的siRNA的总数相似,但QX亚型毒株感染后产生的病毒来源的siRNA(21-23 nt)数量却很少。最后,Western blot结果表明QX亚型毒株通过下调DCs中Dicer和Ago2的表达进而抑制病毒来源的siRNA的产生。此外Dicer的siRNA沉默结果也表明Dicer基因的抑制会促进IBV在DCs中的复制。综上,本研究表明QX亚型毒株通过抑制DCs中Dicer和Ago2的表达进而阻断了病毒来源的siRNA的生成,最终使得病毒可以在树突状细胞中持续复制。 ***调控巨噬细胞RNA干扰经血液在鸡体内传播的研究 体外的研究结果表明M41和QX亚型毒株通过调控巨噬细胞中RNA干扰体系进而影响了病毒在细胞中的复制。携带病毒的细胞可能会通过血液循环到达鸡的组织,为了探究不同亚型毒株在鸡体内的传播差异,本研究使用200μL的M41或QX亚型毒株通过滴眼鼻的方式感染2周龄的鸡,并依次解剖采集不同时间点的组织。首先荧光定量结果表明,巨噬细胞是外周血液内最主要携带IBV的细胞,而非红细胞和其他细胞。其次,只有QX亚型毒株感染组血液中的巨噬细胞的病毒载量是持续上升的。最后,荧光定量和免疫组化结果均表明QX亚型毒株不仅可以感染呼吸道(气管),还可以通过血液巨噬细胞的携带进而传播至更远的腺胃和肾脏组织,而M41亚型毒株则仅能感染和聚集在