脂多糖对马岗鹅雏鹅肝脏危害的探索及验证

作     者：钟粤韵 

作者单位：仲恺农业工程学院 

学位级别：硕士

导师姓名：曹楠;彭新宇

授予年度：2023年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：鹅 LPS 肝脏 肝细胞 凋亡 自噬 p38/MAPK信号通路 

摘      要：由于特殊的生殖器官构造以及生理需求,鹅的生长环境离不开水源。然而在养鹅过程中,水体环境中LPS(Lipopolysaccharide)的污染是一个无法回避的问题。研究发现,外源性LPS的增加会引起鹅肝脏炎症和氧化应激,导致肝损伤,最终影响鹅饲养环境安全及损害经济效应。然而,目前关于LPS对鹅危害的研究多集中在炎症,对于细胞死亡的研究较少并且不够深入细致。因此,探索LPS对鹅肝脏及肝细胞的影响以及产生影响的机制对于防控LPS对水禽的侵害以及保障经济效应是十分必要的。为探索LPS对雏鹅肝脏以及鹅肝细胞的影响,本研究采用单因素随机分组试验设计,将36只1日龄马岗鹅雏鹅分为两组,为对照组与LPS组,每组18只。饲养至第21天,LPS组根据体重腹腔注射5 mg/kg LPS,对照组雏鹅在相同日龄腹腔注射等量生理盐水。注射LPS后于6 h、12 h、24 h采集血清与肝脏样品。体外实验选用胚龄为16～18日龄发育良好的马岗鹅鹅胚分离肝细胞,待细胞贴壁至80%以上,分别添加0μg/m L、0.1μg/m L、1.0μg/m L、10μg/m L浓度的LPS,并于12 h、24 h、36 h收集细胞。使用雏鹅血清、肝脏样品以及鹅胚肝细胞检测血清抗氧化物含量以及细胞中ROS的含量,使用HE染色、透射电镜在组织层面上观察肝细胞变化情况。结果显示:在注射LPS后,雏鹅血清中的SOD、GSH-Px显著下降,MDA含量显著上升,24 h时雏鹅肝脏细胞ROS含量显著增加;通过荧光显微镜以及荧光酶标仪检测鹅胚肝细胞中ROS情况,发现加入LPS后,肝细胞的ROS含量显著增加,LPS引起了肝细胞氧化损伤。注射LPS后,雏鹅肝脏组织切片显示出现肝脏组织结构损伤,产生过量的炎性细胞以及大量自噬小体,并且出现细胞凋亡减少的现象。LPS导致鹅肝脏炎性损伤、鹅肝细胞氧化损伤以及自噬增加与细胞凋亡受到抑制。为进一步探究LPS对雏鹅肝脏及鹅肝细胞细胞凋亡的影响,本试验采用TUNEL技术、流式细胞术以及检测细胞凋亡关键基因caspase3、caspase9、Bcl-2的表达量进行观察。结果显示:LPS组免疫荧光下降,凋亡细胞减少,凋亡基因caspase3、caspase9的表达量与对照组相比显著下降,凋亡抑制基因Bcl-2的表达量显著上升。最终证明了LPS能够抑制雏鹅肝脏及鹅肝细胞的细胞凋亡现象。为了探明LPS抑制雏鹅肝脏及鹅肝细胞细胞凋亡的原因以及证明凋亡和自噬之间的转换关系,本试验通过检测自噬基因m TOR、AKT、PI3K的表达量进行观察。结果显示:LPS组自噬基因m TOR、AKT、PI3K的表达量与对照组相比显著上升,证明LPS增加了雏鹅肝脏及鹅肝细胞自噬现象。为了探明LPS引起的雏鹅肝脏及肝细胞自噬及凋亡异常的分子机制,本试验通过检测p38/MAPK信号通路关键基因p38的表达量,以及添加p38抑制剂(SB203580),观察鹅胚肝细胞内ROS变化情况,以及细胞凋亡、自噬相关基因和蛋白的表达量的变化。结果显示:在雏鹅肝脏及鹅胚肝细胞中,关键基因p38的表达量显著下降;在添加p38抑制剂后,肝细胞ROS含量以及凋亡基因呈下降趋势。抑制p38/MAPK信号通路后,缓解LPS对鹅胚肝细胞细胞凋亡的抑制作用,促进鹅胚肝细胞自噬。最终证明LPS通过p38/MAPK信号通路调控雏鹅肝脏及鹅肝细胞的细胞凋亡及自噬。综上所述,LPS能够引起雏鹅肝脏氧化损伤及肝细胞损伤,通过调控p38/MAPK信号通路在抑制雏鹅肝脏及鹅肝细胞的细胞凋亡的同时增加自噬。本研究的开展和实施为比较医学提供了一定帮助,也为养鹅行业中LPS污染的防控提供了一定的理论依据。