胰蛋白酶激活火龙果WRKY40诱导黄酮合成的机理研究

作     者：张茵茵 

作者单位：河南科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李欣;杨辉

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 

主      题：火龙果 胰蛋白酶 HuWRKY40 转录组 广泛靶向代谢组 VIGS 基因过表达 

摘      要：胰蛋白酶(Trypsin,Try)是一种丝氨酸蛋白水解酶,研究显示其具有清除超氧阴离子的功能,还可调节类黄酮清除自由基的活性,具有良好的果蔬保鲜作用。本论文为了研究胰蛋白酶通过调节类黄酮合成进而影响火龙果保鲜功能的分子机制,结合广泛靶向代谢组学、转录组学和分子遗传学等研究手段,解析了火龙果类黄酮生物合成主要途径中受胰蛋白酶调控的分子机制,筛选到关键基因,验证其编码蛋白的调控机制,为阐明胰蛋白酶影响火龙果保鲜的分子机制提供一定的理论依据。本研究的主要结果如下: (1)广泛靶向代谢组学分析结果显示,类黄酮化合物中,受胰蛋白酶调控最显著的代谢物是儿茶素没食子酸酯(FC=6.2471)。 (2)转录组数据的GO和KEGG富集分析结果表明,6条与类黄酮相关的生物合成途径受到胰蛋白酶调控。同时,火龙果类黄酮合成相关基因表达的相关性分析结果显示细胞可以通过大量基因的弱表达变化来实现其功能,而不仅仅是调节单个基因的显著差异表达。PPI网络的结果显示C4H,HCT和CYP75B1很可能是胰蛋白酶参与调节类黄酮合成的中枢蛋白。结合代谢组和转录组测序结果,“苯丙氨酸/酪氨酸-黄烷酮-二氢槲皮素-无色花青素/二氢杨梅素-儿茶素可能是受胰蛋白酶调节的类黄酮生物合成的主要途径。 (3)火龙果转录组测序的GO富集弦图显示HuWRKY40基因(TRINITY＿DN45344＿c0＿g1)在显著富集的Top10 GO条目(Term)中显著上调;GO有向无环图显示WRKY转录因子家族差异基因主要富集在转录,DNA模板、核酸模板转录、序列特异性DNA结合和DNA结合转录因子活性;KEGG富集分析表明WRKY家族主要富集在植物病原相互作用和MAPK途径;PPI网络的结果显示,HuWRKY40很可能是受胰蛋白酶调节的WRKY家族的枢纽蛋白,与转录组分析结果一致。 (4)火龙果HuWRKY40编码基因933 bp,由310个氨基酸组成,蛋白分子量35.44 kDa,等电点9.01。通过多序列比对,其与甜菜、菠菜的WRKY40同源性最高。利用病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)和过表达结果显示HuWRKY40基因沉默组相比于对照组保鲜表型差异显著。通过黄酮、失重率、总蛋白、可溶性固形物(Total Soluble Solid,TSS)等理化指标的测定,证实HuWRKY40影响黄酮合成,并提高了火龙果贮藏品质。 综合本论文的转录组与代谢组学结果,胰蛋白酶可能通过MAPK级联途径激活HuWRKY40基因诱导黄酮合成,从而延缓果实腐败。