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甘草DXS基因过表达及表达沉默对甘草酸生物合成的影响研究

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药学学报 2021年第7期56卷 2025-2032页

作者：杨林汪逗逗田少凯张智新侯嘉铭肖瑶刘颖北京中医药大学生命科学学院北京102488 北京中医药大学中药学院北京102488

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS)是萜类化合物前体物质合成途径2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate,MEP)途径的第一个限速酶,在甘草次生代谢过程中发挥着重要的调控作用。本课题组在前期转录组研究中发现DXS基因表达水平与甘草的指标性成分甘草酸的含量呈负相关,因此本文拟通过毛状根培养体系,从基因过表达和沉默两方面开展研究,解析DXS基因对甘草酸生物合成的调控作用。本文克隆了甘草DXS基因(GenBank注册号:MN158121);采用基因融合法构建了过表达载体pCA-DXS;根据DXS第一外显子设计sgRNA序列,构建了CRISPR/Cas9基因编辑载体pHSE-DXS;以甘草胚轴为外植体材料,采用发根农杆菌介导法诱导了DXS基因过表达和表达沉默的甘草毛状根体系。同时,诱导了野生型甘草毛状根及含空质粒的阴性对照毛状根。采用UPLC法测定各甘草毛状根样品中甘草酸的含量,结果显示:DXS基因沉默组毛状根样品中甘草酸含量显著高于野生型和阴性对照组,而DXS基因过表达甘草毛状根样品中甘草酸含量则显著低于野生型和阴性对照组。本文通过逆向遗传学策略,从基因过表达和沉默两个方面证实了DXS基因对甘草酸生物合成的负调控作用,为解析DXS基因在萜类化合物代谢中的作用提供了理论依据,也为进一步构建甘草酸生物合成分子调控网络奠定了基础。

关键词：甘草酸 DXS 基因过表达 CRISPR/Cas9 毛状根

基于基因过表达及基因沉默解析F5H基因对甘草酸生物合成的调控研究

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药学学报 2021年第6期56卷 1719-1726页

作者：张智新汪逗逗杨林田少凯肖瑶刘颖北京中医药大学生命科学学院北京102488 北京中医药大学中药学院北京102488

阿魏酸5-羟化酶(ferulate 5-hydroxylase,F5H)是苯丙烷代谢途径上的关键酶。本课题组前期转录组测序研究显示F5H基因在甘草酸生物合成过程中起负调控作用,因此本文拟克隆该基因,并从基因过表达和沉默两个方面对这一调控作用进行深入研... 详细信息

阿魏酸5-羟化酶(ferulate 5-hydroxylase,F5H)是苯丙烷代谢途径上的关键酶。本课题组前期转录组测序研究显示F5H基因在甘草酸生物合成过程中起负调控作用,因此本文拟克隆该基因,并从基因过表达和沉默两个方面对这一调控作用进行深入研究。本文克隆得到甘草F5H基因(GenBank注册号:MK882511);以pCAMBIA1305.1为载体骨架,以Spe I和Bgl II为酶切位点,利用基因融合法构建过表达载体pCA-F5H;根据F5H第一外显子设计sgRNA序列,以pHSE401为载体骨架,以BsaⅠ为酶切位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体pHSE-F5H;使用电转法将pCA-F5H和pHSE-F5H分别转入发根农杆菌ATCC15834感受态细胞;以甘草胚轴为外植体材料,利用发根农杆菌介导法分别诱导F5H过表达及沉默甘草毛状根系。同时,构建野生型甘草毛状根以及携带空质粒的阴性对照甘草毛状根。利用UPLC法测定各甘草毛状根系中甘草酸的含量,结果显示F5H基因沉默甘草毛状根体系中甘草酸含量显著高于野生型和阴性对照组,而过表达F5H基因甘草毛状根系中甘草酸含量则显著低于野生型和阴性对照组。本文通过逆向遗传学策略,从基因过表达和沉默两个方面证实了F5H基因对甘草酸生物合成的负调控作用,为进一步构建甘草酸次生代谢分子调控网络奠定了基础。

关键词： F5H 甘草毛状根甘草酸基因过表达基因沉默 CRISPR/Cas9

mok E基因过表达对红曲霉Monacolin K产量、菌丝及孢子形态的影响

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食品科学 2018年第8期39卷 45-49页

作者：林琳王昌禄李贞景陈勉华武淑芬任志远天津科技大学食品工程与生物技术学院食品营养与安全教育部重点实验室天津300457

红曲霉中mok E基因是红曲霉次级代谢产物Monacolin K生物合成的一个相关基因,mok E基因表达量与Monacolin K产量呈正相关。以mok E基因为目的基因,构建红曲霉mok E基因过表达工程菌株,通过逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse tra... 详细信息

红曲霉中mok E基因是红曲霉次级代谢产物Monacolin K生物合成的一个相关基因,mok E基因表达量与Monacolin K产量呈正相关。以mok E基因为目的基因,构建红曲霉mok E基因过表达工程菌株,通过逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-q PCR)确定mok E基因过表达转化子,对转化子Monacolin K产量进行测定,同时利用扫描电镜,对野生型红曲霉M1及转化子菌丝、孢子进行观察。结果表明:以潮霉素抗性基因为筛选标记,成功得到240个转化子,对其中9个转化子进行mok E基因表达量测定,有3株转化子mok E基因表达量增加,分别为T2、T8、T9转化子,确定其为mok E基因过表达转化子;T2、T8、T9转化子内酯型Monacolin K产量分别为2 159.7、4 177.6、3 365.7μg/g,与野生型红曲霉Monacolin K产量(1 447.8μg/g)相比,分别提高了49.2%、188.5%及132.5%。扫描电镜结果显示,mok E基因过表达,对红曲霉的菌丝体、孢子形态及生殖方式均有影响。

关键词：红曲霉基因过表达 MonacolinK 逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应扫描电镜孢子

关键基因过表达提高酿酒酵母抑制剂耐受性及乙醇发酵性能

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应用与环境生物学报 2018年第3期24卷 541-546页

作者：张克俞张明明赵心清白凤武上海交通大学生命科学技术学院

木质纤维素预处理过程中会产生多种抑制物,抑制酿酒酵母细胞生长及乙醇发酵性能,为挖掘耐性基因、构建新的菌株,进一步提高酿酒酵母对这些抑制物的胁迫耐受性,研究在硫酸锌添加条件下转录组学分析过程中筛选到的可能关键基因ADE17、SSZ1... 详细信息

木质纤维素预处理过程中会产生多种抑制物,抑制酿酒酵母细胞生长及乙醇发酵性能,为挖掘耐性基因、构建新的菌株,进一步提高酿酒酵母对这些抑制物的胁迫耐受性,研究在硫酸锌添加条件下转录组学分析过程中筛选到的可能关键基因ADE17、SSZ1、SET5、PPR1、OGG1和YKL222C过表达对酿酒酵母环境胁迫耐受性的影响.结果显示,不同基因过表达对酿酒酵母在多种抑制物胁迫条件下生长性能的影响不同,其中ADE17过表达对菌株在乙酸、糠醛、苯酚、丙酸和氯化钠胁迫条件下的生长提升最显著,而OGG1和SSZ1过表达对菌株生长的影响相对较弱.进一步对菌株进行驯化,在混合抑制物条件下驯化得到的BADE17-2和BADE17-4菌株延滞期比对照菌株BADE17缩短23 h.上述研究表明,硫酸锌添加从多方面影响了酿酒酵母耐受性,且关键基因过表达对不同环境胁迫条件具有多样性的影响,并且通过基因过表达和驯化方式结合可进一步提高酿酒酵母环境胁迫耐受性,提高纤维素乙醇发酵效率.

关键词：酿酒酵母基因过表达环境胁迫耐受性纤维素乙醇发酵

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酿酒酵母PDC1基因过表达菌株的构建

应用与环境生物学报 2013年第4期19卷 704-708页

作者：柯崇榕吴毕莎邵庆伟杨威黄建忠福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心生命科学学院福州350108 莆田学院环境与生命科学系莆田351100

扩增PDC1全长和Kan基因,构建带有Kanr和Ampr的整合表达载体pSH-PDC1,线性化后LiAc/SS Carrier DNA/PEG法高效转化酿酒酵母YS2-△adh2-△ald6.G418结合PCR筛选获得阳性转化子,然后转入pSH65质粒,半乳糖诱导表达Cre酶切除Kan基因,获得PDC... 详细信息

扩增PDC1全长和Kan基因,构建带有Kanr和Ampr的整合表达载体pSH-PDC1,线性化后LiAc/SS Carrier DNA/PEG法高效转化酿酒酵母YS2-△adh2-△ald6.G418结合PCR筛选获得阳性转化子,然后转入pSH65质粒,半乳糖诱导表达Cre酶切除Kan基因,获得PDC1过表达菌株.荧光定量PCR分析表明过表达菌株PDC1的mRNA表达量是出发菌株的2.078倍,遗传性能稳定,生长情况与出发菌株无明显差异.发酵试验显示过表达菌株蔗糖消耗速率较出发菌株缓慢,乙醇最大积累量为72 h的12.03%,提高了5.62%.利用同源重组原理和Cre-LoxP系统,成功构建PDC1基因过表达突变株并提高了乙醇产量.

关键词：酿酒酵母 PDC1 基因过表达荧光定量PCR 乙醇发酵

hPOT1基因过表达对HeLa细胞细胞周期和凋亡的影响

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基础医学与临床 2005年第5期25卷 429-433页

作者：黄迪南姜英华侯敢广东医学院生物化学与分子生物学研究所广东湛江524023

目的观察人POT1(protectionoftelomeres1)基因过表达对HeLa细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。方法利用本课题组构建的hPOT1基因真核表达重组质粒pcDNA3-hPOT1,经脂质体介导瞬时转染HeLa细胞;通过RT-PCR和EMSA法(电泳迁移率改变分析)检测... 详细信息

目的观察人POT1(protectionoftelomeres1)基因过表达对HeLa细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。方法利用本课题组构建的hPOT1基因真核表达重组质粒pcDNA3-hPOT1,经脂质体介导瞬时转染HeLa细胞;通过RT-PCR和EMSA法(电泳迁移率改变分析)检测外源基因的表达效果,流式细胞术分析细胞周期,Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡。结果pcDNA3-hPOT1重组质粒转染HeLa细胞48h后,mRNA和蛋白质分析表明,外源性hPOT1基因能在HeLa细胞中有效表达,HeLa细胞阻滞于细胞周期S期,而对凋亡无明显影响。结论hPOT1基因可能参与了高等真核细胞细胞周期调控过程,但与细胞凋亡无密切关系。

关键词： HeLa细胞基因过表达 Hoechst33342 电泳迁移率改变分析真核表达重组质粒细胞凋亡 RT-PCR 荧光染色检测细胞周期调控 T1基因脂质体介导 EMSA法流式细胞术蛋白质分析瞬时转染外源基因 mRNA 真核细胞密切关系 hPO

Smac基因过表达对宫颈癌HeLa细胞放疗敏感性的影响

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中华放射医学与防护杂志 2005年第3期25卷 245-247页

作者：郑丽端汪良童强松费世宏熊宙芳伍钢华中科技大学同济医学院附属协和医院病理科武汉430022 华中科技大学同济医学院附属协和医院外科武汉430022 华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心放疗科武汉430022 华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科武汉430022

目的探讨转染Smac基因过表达对宫颈癌细胞放疗敏感性的影响,寻求改善宫颈癌放疗疗效的新途径。方法将Smac基因转染入宫颈癌HeLa细胞株,G418筛选获得亚克隆细胞,RTPCR、Westernblot法检测癌细胞Smac基因表达。X射线照射后,采用MTT比色法... 详细信息

目的探讨转染Smac基因过表达对宫颈癌细胞放疗敏感性的影响,寻求改善宫颈癌放疗疗效的新途径。方法将Smac基因转染入宫颈癌HeLa细胞株,G418筛选获得亚克隆细胞,RTPCR、Westernblot法检测癌细胞Smac基因表达。X射线照射后,采用MTT比色法检测癌细胞体外生长活性;透射电镜、AnnexinV-FITC和碘化丙啶双染色流式细胞仪法检测癌细胞凋亡及比率;Westernblot、比色法检测细胞内Caspase-3蛋白表达和活性水平。结果RTPCR和Westernblot证实所获宫颈癌亚克隆细胞HeLaSmac的SmacmRNA、蛋白表达水平均显著高于HeLa(P表达显著增加(P基因使其在宫颈癌细胞株中过表达,能提高癌细胞中Caspase3的表达和活性,增强放疗对癌细胞的诱导凋亡作用,有望成为改善宫颈癌放疗效果的新途径。

关键词：宫颈癌HeLa细胞放疗敏感性基因过表达 Caspase-3表达 Western RT-PCR HeLa细胞株 Annexin X射线照射 MTT比色法流式细胞仪法细胞生长活性宫颈癌细胞株 Smac基因诱导凋亡作用克隆细胞活性水平蛋白表达 c基因表达

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幽门螺杆菌中基因过表达体系的构建及应用

中国病原生物学杂志 2023年第2期18卷 168-173页

作者：吴豪陕江帆季晓飞田月吴倩文陈思李波清封建凯赵慧琳滨州医学院山东烟台264003

目的在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)体内构建外源基因以及自身基因的过表达系统。方法以绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因,通过同源重组基因敲入和穿梭质粒两种方法构建Hp中基因过表达体系。同源重组法:以预先构建的基因敲除载体... 详细信息

目的在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)体内构建外源基因以及自身基因的过表达系统。方法以绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因,通过同源重组基因敲入和穿梭质粒两种方法构建Hp中基因过表达体系。同源重组法:以预先构建的基因敲除载体pSJHK的衍生质粒pSJHK4为载体,构建gfp基因敲入质粒pSJHK4-gfp,使用Hp鞭毛高表达基因flaA的启动子调控gfp的表达;以hp0547基因区域为插入位点,通过自然转化的方式将质粒转入细菌,胞内通过同源重组将gfp插入到Hp基因组中,荧光显微镜观察gfp表达的荧光情况。穿梭质粒法:将含有鞭毛基因flaA启动子和gfp基因的表达盒连入***穿梭质粒pCHFHP中,构建表达质粒pCHFHP-gfp,自然转化到Hp中,荧光显微镜观察gfp表达的荧光情况。用同样方法构建Hp CagA蛋白(融合有His-tag)的表达质粒pCHFHP-CagA,转入预先构建的Hp CagA敲除株,通过亲和层析纯化重组蛋白,Western blot检测CagA的表达情况。结果构建了gfp基因敲入质粒pSJHK4-gfp,转入Hp后细菌发出绿色荧光;基于穿梭质粒构建了gfp基因表达质粒pCHFHP-gfp,转入Hp中细菌同样发出荧光;进一步构建了CagA的表达质粒并转入Hp CagA敲除株中,Western blot检测到CagA蛋白,并体外纯化获得一定量蛋白。结论基于同源重组基因敲入和穿梭质粒的方法可在Hp中构建外源基因及Hp自体基因的过表达体系,该方法能够为Hp的基因功能研究和致病因子的发掘提供基因操作工具。

关键词：幽门螺杆菌基因过表达同源重组穿梭质粒 CagA

转录因子MSN2基因过表达对酿酒酵母耐受性的影响

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现代食品科技 2018年第9期34卷 95-101,87页

作者：李潇董胜胜付肖蒙王鹏飞董健天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457

cAMP信号通路在调控酵母细胞代谢、增殖、分化及压力抗性的获得过程中具有重要的作用。工业应用中对酵母的耐受性有很高的要求,在发酵过程中,胁迫环境如高温、高渗透压、营养饥饿和高浓度酒精毒性等不可避免,故而提高酵母菌种的耐受性,... 详细信息

cAMP信号通路在调控酵母细胞代谢、增殖、分化及压力抗性的获得过程中具有重要的作用。工业应用中对酵母的耐受性有很高的要求,在发酵过程中,胁迫环境如高温、高渗透压、营养饥饿和高浓度酒精毒性等不可避免,故而提高酵母菌种的耐受性,可以提高菌种的发酵性能,降低发酵过程中的能量消耗。本文构建的突变株在工业应用方面具有重要的意义。以实验室现有菌种AY12a为出发菌株,URA3基因作筛选标记,利用胞内重组,在MSN2基因的N端加上强启动子PGK1_p以实现基因的过表达,最终通过PCR验证,成功构建突变株AY12a-msn2。对酵母进行耐受性的测定,发现AY12a-msn2不具有一定的耐高温性能。同时将突变株与AY12a进行玉米高温浓醪发酵,并测定发酵完成后的酒度、残糖、48 h细胞存活率、CO_2失重及发酵时间。结果发现突变株AY12a-msn2酒度下降,残糖含量上升,48 h细胞存活率上升,发酵时间较长。

关键词：酿酒酵母 cAMP信号通路基因过表达耐受性乙醇