circCSDE1通过海绵化miR-21-3p调控C2C12细胞的增殖与分化
作者单位：山西农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：曹果清;蔡春波
授予年度：2023年
主 题：全转录组测序 猪骨骼肌损伤修复模型 C2C12 circCSDE1 miR-21-3p 增殖 分化 ceRNA
摘 要：骨骼肌生长发育受多种因素调控,其中非编码RNA发挥着重要功能。非编码RNA家族的新成员circ RNA是由不带5′端帽子和3′端POLY(A)尾巴的前体m RNA的某段序列经反向剪接后环化而成,以共价键形成结构性质稳定、在组织和细胞中具有特异性的封闭环状结构,因其功能的广泛性而日益为学术界所关注和探索。试验选取8头90日龄的晋汾白猪分为两组,第一组为正常屠宰后取背最长肌,命名为JFW＿90d;第二组活体麻醉后于脊柱一侧取背最长肌样,该组样品命名为JFW＿MI,将损伤处缝合修复10d后取背最长肌样品,这组样品命名为JFW＿R＿10d。将三组样品进行全转录组测序,通过生物信息学的分析,筛选调控骨骼肌生长发育的circ RNAs(circ CSDE1);通过正反引物扩增试验、Sanger测序和RNase R酶消化试验鉴定circ CSDE1的成环能力;通过构建组织表达谱、时序表达谱和亚细胞定位探究circ CSDE1的表达模式;过表达和干扰circ CSDE1后,采用q RT-PCR、Ed U和免疫荧光分别检测C2C12细胞的增殖和分化效果;采用RNAhybrid、mi RDB等软件预测circ CSDE1的靶向mi RNA以及下游的靶基因,通过Cytoscape构建circ CSDE1的ce RNA网络;通过双荧光素酶报告试验和q RT-PCR验证circ CSDE1与mi R-21-3p以及mi R-21-3p与细胞周期蛋白依赖性激酶16(cyclin dependent kinase 16,CDK16)的结合能力;过表达和干扰mi R-21-3p后,采用q RT-PCR、Ed U和免疫荧光分别检测C2C12细胞的增殖和分化效果;最后通过挽救实验探究circ CSDE1与mi R-21-3p对C2C12细胞成肌分化的调控作用。研究结果如下:1、全转录组测序结果显示,本次测序共鉴定出17 532个circ RNAs,大部分来源于基因外显子区域。与90d组相比,R＿10d组中产生了406个差异表达的circ RNAs,其中241个上调和165个下调;与MI组相比,R＿10d组中产生了85个差异表达的circ RNAs,其中42个上调和43个下调。3个circ RNAs(circ＿0010134,circ＿0007453 and circ＿0006532)在不同处理组中共表达。2、circ＿0006532(circ CSDE1)的环化位点序列为CAATG,能够稳定存在,不具备编码蛋白的能力;circ CSDE1在脂肪、肺和骨骼肌中有较高的表达量,且主要在细胞质中表达;circ CSDE1在猪骨骼肌发育的0至90 d时表达量呈缓慢下降的趋势,在90至180 d时呈迅速上升的趋势。3、circ CSDE1的ce RNA网络图显示其有5个潜在靶mi RNA和31个潜在的下游靶基因。根据靶基因的功能,发现circ CSDE1/mi R-21-3p/CDK16可能影响骨骼肌发育的调控轴。随后分别验证了circ CSDE1与mi R-21-3p、mi R-21-3p与CDK16的结合能力。4、C2C12细胞中过表达circ CSDE1,mi R-21-3p的表达量极显著降低(P0.01),CDK16表达量极显著上升(P0.01),增殖标志基因Pcna、Cdk4和Mki67的表达升高,细胞增殖加快,而分化标志基因Myod1、Myog和Myhc的表达降低,肌管形成减少;C2C12细胞中敲低circ CSDE1的表达量后增殖标志基因表达减少,细胞增殖减缓,而分化标志基因表达升高,肌管形成增多。C2C12细胞中过表达mi R-21-3p,CDK16表达量显著降低(P0.05),增殖标志基因Pcna、Cdk4和Mki67的表达降低,细胞增殖减缓,而分化标志基因Myod1、Myog、Myhc和Myf5的表达升高,肌管形成增多;C2C12细胞中敲低mi R-21-3p的表达量后增殖标志基因表达升高,细胞增殖加快,而分化标志基因表达降低,肌管形成减少。在C2C12细胞中同时过表达或敲低circ CSDE1和mi R-21-3p进行挽救实验,circ CSDE1能够减缓mi R-21-3p对C2C12细胞分化的促进作用,表明circ CSDE1能够通过靶向mi R-21-3p对成肌细胞的生长发育起调控作用。总之,通过构建猪骨骼肌损伤修复模型和全转录组测序,我们发现并鉴定了一种新型的环状非编码RNA-circ CSDE1,它能够抑制mi R-21-3p对成肌细胞分化的促进作用,证明circ CSDE1能够通过ce RNA机制来调控骨骼肌的生长发育。因此,circ CSDE1/mi R-21-3p/CDK16的调控轴能为促进猪肌肉的生长发育或肌肉类疾病的治疗提供
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