蕲艾中咖啡酸、异绿原酸A等绿原酸类成分的化感抑草效应及其作用机制研究

作     者：陈乐 

作者单位：湖北中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘大会

授予年度：2022年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：蕲艾 水提物 UPLC-QTOF-MS 咖啡酸 异绿原酸A 抑草效应 生理机制 分子机制 

摘      要：艾（Artemisia Argyi Lé*** Van.）是菊科蒿属多年生草本植物,其干燥叶片为我国传统中药材。艾叶按照应用历史和产地,分为北艾、海艾、蕲艾和祁艾等道地药材。艾叶在亚洲分布广泛,主要分布在中国、日本和韩国,具有较强的生态适应性。前期研究发现,将蕲艾艾粉作为肥料施用时田间杂草数量和生物多样性显著下降。进一步实验证实,蕲艾提取物对白菜（Brassica pekinensis）、生菜（Lactuca sativa）和水稻（Oryza sativa）的种子萌发和幼苗生长有较强的抑制作用,其中水提物的抑制作用最强。植物化感作用是一种广泛存在的生物现象,是指植物分泌的次生代谢物或其分解产物释放到土壤和环境中,影响其他植物的生长发育。目前,化感植物分泌的大量化感物质被认为是植物在生态竞争中占优势的重要原因,并可利用其有效控制杂草。因此,本文对蕲艾水提物中的化感抑草活性物质及其作用机制展开系统研究,为阐明艾叶生态优势和开发绿色除草剂提供科学依据。目的:评价蕲艾水提物的化感抑草活性,筛选鉴定其化感抑草作用的有效成分,阐明有效活性成分抑草作用的生理生化和分子机制,为艾叶综合开发利用提供理论依据。方法:1.采用培养箱试验评价不同浓度蕲艾水提物溶液对4种田间常见有害杂草稗草、狗尾草、马齿苋和反枝苋的化感抑草活性,并利用UPLC-QTOF-MS和HPLC法初步解析其药效物质基础。2.以狗尾草和马齿苋为研究对象,采用培养箱试验测定蕲艾水提物中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸和隐绿原酸4种含量丰富的酚酸类成分的化感抑草作用;运用生物活性导向分离法和UPLC-QTOF-MS技术相结合的方式分离鉴定蕲艾水提物中的关键化感活性物质,通过6种不同科属的杂草评价其广谱抑草活性;此外,利用HPLC法检测蕲艾向其生长环境中释放的化感物质种类,并综合分析蕲艾水提物中化感物质结构相似性。3.以狗尾草为模式植物利用体视显微镜、光学显微镜、透射电镜、生理指标检测研究蕲艾中主要化感物质对杂草叶片的生理效应。4.利用转录组测序综合分析蕲艾中主要化感物质处理后狗尾草叶片中的差异表达基因（P隐绿原酸新绿原酸绿原酸,咖啡酸为蕲艾水提物中含量最高且化感作用较强的化合物。经过一系列的生物活性指导分离、纯化和核磁鉴定,异绿原酸A（ICGAA）被鉴定为蕲艾活性部位（Fr.C-3）中最重要的化感活性物质;不同浓度的异绿原酸A溶液（250、500、1000μM）能显著抑制稗草、狗尾草、马唐、马齿苋、空心莲子草和藜等不同科属杂草的生长,显示出作为广谱抑草潜力,并通过盆栽实验以狗尾草进行了验证。3.经HPLC法检测蕲艾生长地中表层土壤中的化学成分,发现蕲艾可向环境中释放异绿原酸A、咖啡酸、绿原酸等物质,表明这些物质均为蕲艾中重要的化感物质;综合分析蕲艾水提物中的多种化感活性成分发现,它们具有结构相似性,均为咖啡酸和奎宁酸缩合生成的单咖啡酰奎宁酸和双咖啡酰奎宁酸,可统称为绿原酸类物质。4.利用体视显微镜观察到,随着咖啡酸浓度升高（250、500、1000μM）,狗尾草叶片逐渐出现卷曲、发黄和干枯的现象。1000μM异绿原酸A处理后同样严重阻碍了狗尾草叶片的生长发育,且光学显微镜观察发现狗尾草叶尖细胞横切面中上、下表皮细胞严重萎缩,叶脉维管束细胞膨大,内部叶绿素减少;透射电镜则发现超微结构中细胞膜和细胞器严重降解。同时,在咖啡酸处理下,叶片中活性氧（ROS）积累爆发,脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量上升;且在1000μM浓度下,过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性均显著性降低。这些结果表明咖啡酸、异绿原酸A等绿原酸类成分可通过破坏叶片的生理结构、导致氧化损伤、扰乱抗氧化酶活性发挥抑草活性。5.转录组测序和实时荧光定量PCR（RT-q PCR）分析发现咖啡酸处理后叶片中下调基因富集的“二萜类物质生物合成和“