杨树桑黄多糖合成代谢相关基因挖掘及高产菌株的筛选

作     者：徐丛涛 

作者单位：牡丹江师范学院 

学位级别：硕士

导师姓名：弥春霞;邹亚杰

授予年度：2024年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：杨树桑黄 多糖 抗氧化活性 代谢通路 磷酸葡萄糖变位酶 磷酸葡萄糖异构酶 

摘      要：杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)含有丰富的活性物质,其多糖是杨树桑黄的主要成分,具有抗肿瘤、抗氧化等多种功效。长期以来杨树桑黄多糖的获取主要采用菌丝体发酵的形式,并辅以发酵参数优化及外源添加诱导物的方式提高多糖产量。目前,随着杨树桑黄基因组测序的完成为我们在分子水平上构建杨树桑黄多糖高产菌株提供了可能,并且可以通过测定多糖代谢通路中多种关键基因的表达量变化,为研究杨树桑黄多糖代谢途径提供参考。本文首次对杨树桑黄多糖生物合成途径中的磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase pgm)与磷酸葡萄糖异构酶(Phosphoglucose isomerase pgi)两个关键酶基因的功能进行研究,并筛选获得了桑黄多糖高产菌株。主要研究结果如下:1.分子克隆获得杨树桑黄Svpgm基因序列,构建过表达和干扰载体。农杆菌介导转化菌丝筛选转化子,然后对Svpgm开展功能分析。Svpgm基因的c DNA长1 353 bp,编码451个氨基酸,是一种稳定的亲水性蛋白。Svpgm过表达菌株胞外多糖含量相对野生型菌株分别提高了7.72%和15.15%,胞内多糖含量相对野生型分别降低了22.72%和36.14%;Svpgm干扰菌株胞外多糖含量相对野生型分别减少了22.72%和36.14%,胞内多糖含量相对野生型分别提高了33.68%和38.24%。菌丝长速与生物量也发生显著变化,干扰菌株与野生型相比菌落直径分别减小了14.83%和17.86%,菌丝生物量分别减少了19.76%和33.95%;过表达菌株与野生型相比菌落直径分别增大了12.14%和13.61%,菌丝生物量分别增加了83.48%和126.65%。酶活性分析显示与野生型相比,过表达菌株酶活性分别提高了16.00%和24.31%;干扰菌株酶活性分别降低了37.72%和42.28%。此外还对催化的两种中间代谢产物含量进行了测定,发现在杨树桑黄中Svpgm主要调控方向为G-1-P向G-6-P之间的相互转化,并能够影响细胞壁组分中几丁质和β-葡聚糖含量,过表达菌株中几丁质含量分别降低了28.98%和42.72%,β-葡聚糖含量分别升高了38.89%和49.17%;干扰菌株中几丁质含量分别升高了78.74%和89.26%,β-葡聚糖含量分别降低了8.25%和18.46%。葡萄糖流向不同的代谢分支,导致单糖组成发生变化。提取菌丝体多糖,并对抗氧化活性进行比较,发现在测定浓度范围内,抗氧化活性与多糖浓度呈正比,且与野生型相比干扰菌株的抗氧化活性显著增强,而过表达菌株则受到抑制,抗氧化活性显著降低。对上下游相关基因表达量测定,pgi在过表达菌株中上调表达,UGPase、ugdh、uxs在干扰菌株中上调表达,uge在所有转化子中都表现为下调趋势,以上结果说明Svpgm基因在杨树桑黄多糖代谢途径中发挥负调控作用。2.分子克隆获得杨树桑黄Svpgi基因序列,构建过表达和干扰载体。农杆菌介导转化菌丝筛选转化子,然后对Svpgi进行功能分析。Svpgi基因c DNA长1 659 bp,共编码553个氨基酸,是一种稳定的亲水性蛋白。Svpgi过表达菌株胞外多糖含量相对野生型菌株分别提高了30.18%和31.04%,胞内多糖含量相对野生型菌株分别降低了7.95%和13.60%;Svpgi干扰菌株胞外多糖含量相对野生型菌株分别提高了43.52%和47.78%,胞内多糖含量相对野生型菌株分别提高了49.70%和63.84%。Svpgi基因干扰表达时菌丝生长受到抑制,与野生型菌株相比菌落直径分别减小了9.50%和15.12%,菌丝生物量分别减少了50.92%和59.98%;当Svpgi基因过表达时,与野生型相比菌落直径分别增大了4.94%和8.19%,菌丝生物量分别增加了41.37%和47.62%。此外还对催化的两种中间代谢产物含量进行了测定,发现在杨树桑黄中Svpgi主要调控方向为G-6-P向F-6-P之间的相互转化。过表达菌株与干扰菌株的细胞壁构成具有相似的变化,其中几丁质含量在过表达菌株中分别升高了28.64%和34.94%,在干扰菌株中分别升高了10.17%和13.03%;β-葡聚糖含量在过表达菌株中分别降低了1.13%和2.30%,在干扰菌株中分别降低了27.25%和29.90%。葡萄糖在不同代谢分支的流向也受到影响,导致单糖组成和比例发生变化,其中半乳糖含量在胞内多糖中升高。对胞内多糖的抗氧化活性进行比较,结果显示不同处理组分间菌株抗氧化活性存在显著差异,转化子抗氧化活性强于野生型菌株。对上下游相关基因表达量测定,pfk、pmi在过表达菌株上调表达,pgm、UDPase、ugdh、uge在干扰菌株中上调表达,以上结果表明Svpgi基因在杨树桑黄多糖代谢途径中发挥负调控作用,但对于胞外