糖基化修饰对牛乳铁蛋白结构和功能特性的影响研究

作     者：罗洲 

作者单位：成都大学 

学位级别：硕士

导师姓名：程杰

授予年度：2024年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083201[工学-食品科学] 

主      题：牛乳铁蛋白 糖基化修饰 糖基化共价复合物 功能特性 热稳定性 

摘      要：活性蛋白质因具有良好的生物活性、生物相容性以及多种生理功能,常以营养添加剂应用于食品工业,增强产品的营养价值和功能性,如提供活性肽段和必需氨基酸等营养物质。此外,部分活性蛋白在医药领域还有着重要的药理学应用,如药物载体等。乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）具有广泛的生物学功能,目前被作为营养补充剂广泛应用于保健食品和婴幼儿食品,并且在未来食品和药品领域有着广泛的应用前景。如功能性乳制品的开发,食品功能因子传递系统和药物传递系统的构建。然而,天然LF存在乳化性不足、抗氧化能力不足、热稳定性极差等问题限制了在这些领域的应用。糖基化修饰蛋白质是解决这一类问题的有效方法,通过糖分子共价接枝生成的糖基化共价复合物往往具有更优异的性质,但是受到糖分子、蛋白质类型和反应条件影响。糖基化修饰LF的报道较少,因而研究LF的糖基化修饰对扩展LF在食品和药品领域的应用有着重要意义。本研究以牛乳铁蛋白（LF）与葡萄糖（Glu）、壳寡糖（COS）、麦芽糊精（MD）和低聚异麦芽糖（IMO）为研究对象,制备一系列糖基化共价复合物,探究了不同糖分子对LF热稳定性和功能性质（乳化性、起泡能力和抗氧化性）的影响,并从光谱学和分子对接研究深入探讨了糖基化修饰改善LF功能特性的内在机理。具体研究内容如下: （1）在控制反应温度和糖/蛋白比例（糖浓度0.5%、蛋白浓度2%,糖:蛋白为1:4）的条件下,研究了反应时间对LF在糖基化修饰过程中的接枝度、褐变指数和乳化性的影响。接枝度呈现先迅速增大后缓慢下降的趋势,并且接枝速率为GluCOSIMOMD。以糖基化共价复合物在A和A的吸光值作为褐变指数,褐变指数持续上升表明了美拉德中期和后期产物在持续生成。反应时间为3 h的LF-Glu,2 h的LF-COS,5h的LF-MD和2 h的LF-IMO有着最优乳化活性,此时乳化稳定性较好。以SDS-PAGE验证糖分子成功共价接枝于LF。以DSC分析天然LF和糖基化共价复合物的热稳定性,结果显示糖基化修饰提高了LF的热稳定性。 （2）对不同糖分子修饰制备的最优乳化活性的糖基化复合物的乳化性、起泡能力和抗氧化性进行比较。乳化活性为:LF-MDLF-IMOLF-GluLF-COS,LF-IMO乳化稳定性最佳,LF-COS乳化稳定性最差。以界面蛋白吸附率和纳米乳液微观结构表征分析乳化能力提升的本质原因,以粒径和ζ电位探讨影响因素。乳化稳定性影响因素较多,能形成均一乳液的共价复合物乳化稳定性较好,并且电荷性极大影响了乳液的稳定性。糖基化共价复合物明显具有更加优良的起泡能力,这可能与共溶体系粘度的增加和接枝糖链增加了LF在气/液界面的吸附能力有关。最后以ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率和还原能力共同分析抗氧化性的变化。LF-COS抗氧化性最佳,反应时间的延长会有利于抗氧化性的增加,这与褐变指数增加程度有着直接关系,表明美拉德反应中期和后期产物的生成是抗氧化性提升的主要因素。 （3）从光谱学方面对不同糖基化共价复合物的三级结构和二级结构进行分析,以结构影响性质为出发点深度解剖糖基化改善LF乳化性和起泡性的内在机理。综合分析了LF表面疏水性、内源荧光光谱和总巯基的变化。内源荧光光谱红移,表明疏水性残基被在糖基化修饰之后从蛋白质分子内部暴露出来,表面疏水性增加,而亲水性糖分子糖基化修饰降低了LF的表面疏水性,从而糖基化共价复合物表面疏水性降低。糖基化修饰明显改变了LF的三级构象,亲疏水性平衡的改变可能是性质改善的重要原因。FT-IR和CD光谱表明了LF在被糖基化修饰之后二级结构发生明显变化,α-Helix含量下降、β-Sheet含量上升使得糖基化共价复合物更具柔韧性,协同糖分子共价接枝提高了空间位阻从而促进功能性质的改善。分子对接展示了糖分子与LF相互作用模式,推测了LF可能优先发生糖基化修饰的区域,并表明糖分子与LF之间形成的分之间氢键和疏水作用可能会影响糖基化共价复合物乳化性和起泡能力。