基于DNA酶辅助信号放大的微芯片电泳的单细胞分析方法研究

作     者：许春欢 

作者单位：广西师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵书林

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：微芯片电泳 单细胞 信号放大 DNA酶 

摘      要：细胞是构成生物的形态和生理功能的基本单位,普遍存在的细胞异质性导致细胞化学成分、生物活性、物理反应等方面存在差异。单细胞分析可以揭示不同细胞群体中细胞间的差异,是更好地了解细胞生物学和提高早期疾病检测能力的重要策略。由于许多细胞内组分在单个细胞中的含量很低,因此对单细胞内的超低含量组分进行绝对定量分析仍然是一个巨大的挑战。微流控芯片技术是快速和高通量分析单细胞的重要技术之一,该技术可以实现精确的流体控制,单细胞的操纵以及不同组分的定量分析等。尽管单细胞分析方法取得了重大进展,但在单细胞超低含量组分的分析上仍存在一定的挑战,例如选择性差和检测限低,因此对单细胞分析方法的要求也向具有更好特异性和更高灵敏度的方向发展。近几年,核酸信号放大技术和微流控芯片电泳相结合快速发展,为单细胞超低含量组分分析提供了解决策略。基于此,本论文在微流控芯片平台上,基于DNA酶（DNAzyme）辅助的信号放大方法,用于单细胞水平上脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（APE1）活性的检测,单细胞中survivin mRNA的定量和单细胞中miRNA-155、miRNA-373和miRNA-21的同时定量。主要研究内容如下:1.提出了一种基于微芯片电泳平台的DNAzyme催化耦合滚环信号放大的策略,用于单细胞水平上APE1的检测。设计了发夹和环状模板探针,验证了该策略的可行性,并且优化实验条件。在最优条件下,对Hela细胞裂解液的APE1进行检测,在1～800细胞数范围内APE1具有良好的线性关系,线性方程为Y=0.0817N+12.5168,R=0.9967,检测限低于1个Hela细胞水平,该策略有望应用于单细胞APE1的分析研究。2.发展了一种基于DNAzyme催化耦联钳位杂交链反应的DNA机器用于测定单细胞中的survivin mRNA。利用十字形支架与发夹H0杂交形成的“四叶草结构核心支架,可在四个方向同时触发靶标对H0的识别,将检测灵敏度提高了六个数量级。通过对实验的条件进行优化,在最优条件下,对survivin mRNA进行了分析,线性范围为2.0×10mol/L～1.0×10mol/L,线性方程为Y=4.5277 lg C+62.1,相关系数R=0.9989,检测限为5.0×10mol/L。该方法成功应用于单个细胞survivin mRNA的分析,取得的结果可以为单细胞生物学研究提供重要的见解。3.建立了一种框架核酸辅助三元同时串联信号放大方法用于单细胞中的多种miRNAs的定量。在框架核酸上连接多个发夹和多个底物,作为目标识别单元,信号方法单元和信号输出单元。在最优的条件下对三种miRNAs进行了测定,miRNA-155、miRNA-373和miRNA-21检测限分别为10 fmol/L,2 fmol/L和1 fmol/L。该方法成功用于单个细胞内的miRNA-155、miRNA-373和miRNA-21同时定量分析。这为同时分析单细胞中多种miRNAs提供了一种新思路,对研究miRNAs与癌症疾病的关系具有重要意义。