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dna酶:筛选、生物传感及展望

高等学校化学学报 2020年第11期41卷 2345-2355页

作者：佟宗轩胡沁沁顾宏周复旦大学附属中山医院心血管疾病研究所复旦大学生物医学研究院上海200032

综述了脱氧核糖核酸酶(dna酶)的起源及分离富集策略,对比了dna酶与核糖核酸酶(RNA酶)及蛋白酶的相似点和不同之处,并重点讨论了产物捕获和对冲抵消等策略对筛选获得dna酶的独到之处;同时系统回顾了近年来分离出的可特异感应各种金属离... 详细信息

综述了脱氧核糖核酸酶(dna酶)的起源及分离富集策略,对比了dna酶与核糖核酸酶(RNA酶)及蛋白酶的相似点和不同之处,并重点讨论了产物捕获和对冲抵消等策略对筛选获得dna酶的独到之处;同时系统回顾了近年来分离出的可特异感应各种金属离子或生物样本(包括细菌、细胞等),从而能在特定位点切割RNA底物的dna酶探针;阐述了dna酶领域现存的挑战,总结和展望了新思路和新方向.

关键词： dna酶 dna催化指数富集的配体系统进化技术(SELEX) 筛选策略

dna酶裂解-纳米金共振瑞利散射光谱法测定痕量Cu^(2+)

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光谱学与光谱分析 2013年第1期33卷 147-150页

作者：王盛棉吴蒙梁爱惠蒋治良广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室广西环境污染控制理论与技术重点实验室广西桂林541004 柳州市卫生学校广西柳州545005

在pH 7.0HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液中和0.19mol.L-1 NaCl存在下,单链底物dna(SS)和酶链dna(ES)在80℃杂交形成双链dna(dsdna)。Cu2+可切割dsdna中的底物链释放出单链dna(ssdna),此ssdna与金纳米粒子(NG)作用形成NGssdna结合物不被NaCl聚集,而未保护的NG聚集形成较大粒径的聚集体(NGA),在627nm处有一个较强的共振瑞利散射峰。随着Cu2+浓度的增大,该共振瑞利散射峰降低,其降低值ΔI与Cu2+浓度在15～1 250nmol.L-1范围呈线性关系,其回归方程为ΔI=0.17c-2.3,线性相关系数为0.989 5,检出限为8nmol.L-1。据此建立了一个高灵敏、高选择性、简便测定Cu2+的共振瑞利散射光谱分析法。该法用于水样中Cu2+的检测,结果满意。

关键词： Cu2+ dna酶纳米金共振瑞利散射光谱法

基于dna酶辅助信号放大的微芯片电泳的单细胞分析方法研究

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基于DNA酶辅助信号放大的微芯片电泳的单细胞分析方法研究

作者：许春欢广西师范大学

学位级别：硕士

细胞是构成生物的形态和生理功能的基本单位,普遍存在的细胞异质性导致细胞化学成分、生物活性、物理反应等方面存在差异。单细胞分析可以揭示不同细胞群体中细胞间的差异,是更好地了解细胞生物学和提高早期疾病检测能力的重要策略。由... 详细信息

细胞是构成生物的形态和生理功能的基本单位,普遍存在的细胞异质性导致细胞化学成分、生物活性、物理反应等方面存在差异。单细胞分析可以揭示不同细胞群体中细胞间的差异,是更好地了解细胞生物学和提高早期疾病检测能力的重要策略。由于许多细胞内组分在单个细胞中的含量很低,因此对单细胞内的超低含量组分进行绝对定量分析仍然是一个巨大的挑战。微流控芯片技术是快速和高通量分析单细胞的重要技术之一,该技术可以实现精确的流体控制,单细胞的操纵以及不同组分的定量分析等。尽管单细胞分析方法取得了重大进展,但在单细胞超低含量组分的分析上仍存在一定的挑战,例如选择性差和检测限低,因此对单细胞分析方法的要求也向具有更好特异性和更高灵敏度的方向发展。近几年,核酸信号放大技术和微流控芯片电泳相结合快速发展,为单细胞超低含量组分分析提供了解决策略。基于此,本论文在微流控芯片平台上,基于dna酶（dnazyme）辅助的信号放大方法,用于单细胞水平上脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（APE1）活性的检测,单细胞中survivin mRNA的定量和单细胞中miRNA-155、miRNA-373和miRNA-21的同时定量。主要研究内容如下:1.提出了一种基于微芯片电泳平台的dnazyme催化耦合滚环信号放大的策略,用于单细胞水平上APE1的检测。设计了发夹和环状模板探针,验证了该策略的可行性,并且优化实验条件。在最优条件下,对Hela细胞裂解液的APE1进行检测,在1～800细胞数范围内APE1具有良好的线性关系,线性方程为Y=0.0817N+12.5168,R=0.9967,检测限低于1个Hela细胞水平,该策略有望应用于单细胞APE1的分析研究。2.发展了一种基于dnazyme催化耦联钳位杂交链反应的dna机器用于测定单细胞中的survivin mRNA。利用十字形支架与发夹H0杂交形成的“四叶草”结构核心支架,可在四个方向同时触发靶标对H0的识别,将检测灵敏度提高了六个数量级。通过对实验的条件进行优化,在最优条件下,对survivin mRNA进行了分析,线性范围为2.0×10mol/L～1.0×10mol/L,线性方程为Y=4.5277 lg C+62.1,相关系数R=0.9989,检测限为5.0×10mol/L。该方法成功应用于单个细胞survivin mRNA的分析,取得的结果可以为单细胞生物学研究提供重要的见解。3.建立了一种框架核酸辅助三元同时串联信号放大方法用于单细胞中的多种miRNAs的定量。在框架核酸上连接多个发夹和多个底物,作为目标识别单元,信号方法单元和信号输出单元。在最优的条件下对三种miRNAs进行了测定,miRNA-155、miRNA-373和miRNA-21检测限分别为10 fmol/L,2 fmol/L和1 fmol/L。该方法成功用于单个细胞内的miRNA-155、miRNA-373和miRNA-21同时定量分析。这为同时分析单细胞中多种miRNAs提供了一种新思路,对研究miRNAs与癌症疾病的关系具有重要意义。

关键词：微芯片电泳单细胞信号放大 dna酶

基于核酸扩增结合dna酶的比色方法在大米中OTA的检测研究

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基于核酸扩增结合DNA酶的比色方法在大米中OTA的检测研究

作者：夏怀月湘潭大学

学位级别：硕士

赫曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）作为毒性较强的真菌毒素之一,具有致癌、致畸以及肾毒性,对人体伤害很大。基于比色传感技术的OTA检测方法具有肉眼可见、操作简单等优点,但缺点是灵敏度不高。因此,构建出高灵敏度、可视化的OTA检测方... 详细信息

赫曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）作为毒性较强的真菌毒素之一,具有致癌、致畸以及肾毒性,对人体伤害很大。基于比色传感技术的OTA检测方法具有肉眼可见、操作简单等优点,但缺点是灵敏度不高。因此,构建出高灵敏度、可视化的OTA检测方法至关重要。本论文以OTA为检测对象,核酸适配体（Apt）为识别元件,结合核酸等温扩增技术,构建了三种不同的比色传感技术用于食品中OTA的检测。具体内容如下:1、基于Mg依赖性dna酶（MNAzyme）裂解策略,构建了一种比色传感技术以提高比色法的灵敏度并将其应用于检测大米中的OTA。我们通过碱基互补配对原则设计了一种四链体复合物（Apt-dna1-dna2-MNAzyme）。在OTA存在的情况下,Apt与OTA结合,使四链体复合物结构受到破坏,释放出MNAzyme链。当加入发夹底物（HP）后,MNAzyme识别修饰在HP上的核糖核苷酸（r A）位点并对HP产生切割作用,释放出封闭在HP上的一段富G序列。该序列在K存在时与血红素（hemin）结合形成具有辣根过氧化物酶活性的dna酶,催化双氧水（HO）氧化2,2’-联氨-双-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二氨盐（ABTS）,产生颜色变化。该方法在0.5 n M-25 n M范围内,OTA的浓度与吸光度之间有良好的线性关系,检出限为0.41 n M。大米中OTA的加标回收率在93.6%-108.6%范围内,说明该方法能较好地识别复杂体系中的OTA。2、单一的核酸等温扩增技术对于比色法灵敏度提升有限,因此,利用Apt特异性结合OTA,构建了一种基于级联信号放大技术的比色传感技术进一步提升比色法的灵敏度,并成功实现了大米中OTA的检测。当体系中有OTA存在时,其与Apt结合,释放出的dna1与溶液中的dna2结合形成MNAzyme,催化裂解发夹底物（H1）产生dna3和dna4。其中dna3打开发夹H2释放出封闭在H2上的一段MNAzyme单链,继续对H1循环裂解。通过裂解产生的dna4进一步启动EDC循环,释放大量富G序列,形成hemin/G四链体dna酶,进而催化HO介导的生色底物ABTS显色。该方法展示了高的灵敏度、强的选择性,其检出限为48.97 f M,线性范围为100 f M-10 n M。成功地实现了大米样品中加标OTA的检测,具有很大的应用价值。3、快速可视化检测对于OTA的早期监控具有重要意义,因此,基于无酶和级联扩增策略,构建了一种比色传感技术用于快速检测大米中的OTA。其中,级联扩增过程由EDC、催化发夹组装（CHA）以及MNAzyme组成。通过OTA与其Apt的特异性结合,释放一条起始链启动上游EDC,然后产生一个新的触发单元,促使下游CHA生成MNAzyme,进一步裂解底物链（H4）,诱导形成hemin/G四链体dna酶作为信号读数。基于级联放大的比色传感技术具有选择性好,易于操作等优点,该方法的线性检测范围为10 f M-100 p M,检测限低至8.7 f M。此外,当反应时间在20 min时溶液具有明显的颜色变化。

关键词：赭曲霉毒素A 核酸适配体信号放大 dna酶比色法

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dna酶的设计、选择及催化动力学研究

化学通报 2013年第7期76卷 617-623页

作者：李英余晓冬徐静娟陈洪渊南京大学化学化工学院生命分析化学国家重点实验室南京210093 中国科学院

设计了12条能与血晶素相互作用形成dna酶的寡核苷酸链,并研究了它们催化4种不同底物[2,2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸)二铵盐、2,7-二氯二氢荧光素二乙酯、酪胺、四甲基联苯胺]的催化活性及动力学过程。结果表明,G-四分体中碱基G... 详细信息

设计了12条能与血晶素相互作用形成dna酶的寡核苷酸链,并研究了它们催化4种不同底物[2,2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸)二铵盐、2,7-二氯二氢荧光素二乙酯、酪胺、四甲基联苯胺]的催化活性及动力学过程。结果表明,G-四分体中碱基G形成的平面结构的层数、可以形成类发夹结构的互补dna短链、G-四分体侧环上碱基的个数以及类发夹结构连接臂上碱基的个数等因素均影响血晶素与dna的相互作用。除此之外,dna酶的催化活性不仅与血晶素和dna的结合常数有关,同时也受底物分子结构的影响。在所设计的12种dna酶中,2,2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸)二铵盐是理想的比色测定底物,而酪胺是理想的荧光测定底物。

关键词： G-四分体血晶素 dna酶

基于磁纳米颗粒的二段对称分裂式G-四分体dna酶生物传感器用于Hg^(2+)的快速检测

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化学学报 2014年第9期72卷 1029-1035页

作者：张佳佳代佩卿李超李南忘程圭芳何品刚方禹之华东师范大学化学系上海200241

提出了一种可用于Hg2+快速检测的基于磁纳米颗粒与二段对称分裂式G-四分体dna酶的生物传感器.分别用紫外-可见光谱法,圆二色光谱法和荧光显微镜成像技术对实验设计的dna酶传感器进行了表征.传感器中磁纳米颗粒的应用不仅可以直接从水样... 详细信息

提出了一种可用于Hg2+快速检测的基于磁纳米颗粒与二段对称分裂式G-四分体dna酶的生物传感器.分别用紫外-可见光谱法,圆二色光谱法和荧光显微镜成像技术对实验设计的dna酶传感器进行了表征.传感器中磁纳米颗粒的应用不仅可以直接从水样中通过磁分离方法分离和富集被测物Hg2+,并且还能将游离的未与Hg2+结合的dna酶和hemin等除去,有效地提高检测灵敏度和降低背景信号;此外,二段对称分裂式G-四分体dna酶的运用还可增强传感器的灵活性和选择性.传感器对Hg2+检测的线性范围为0.8~20 nmol/L,检出限为0.3 nmol/L.当水体中的共存离子大量存在时,传感器对Hg2+的检测仍具有高度特异性.对实际水样的检测回收率在95.3%~104.4%之间.实验设计的dna酶传感器操作简便,费用低廉,具有良好的再生能力.可用于天然水体和饮用水样品中痕量Hg2+的检测.

关键词：磁纳米颗粒二段对称分裂式G-四分体 dna酶生物传感器比色法 Hg^2+

基于dna酶/AuNPs-GO传感器方波伏安法高灵敏检测Pb2+

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分析化学 2021年第2期49卷 309-317页

作者：杨瑞康天放鲁理平叶青北京工业大学区域大气复合污染防治北京市重点实验室环境与能源工程学院

制备了金纳米粒子-氧化石墨烯（AuNPs-GO）复合物,采用透射电镜（TEM）和紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）对其进行了表征。将此复合物修饰到玻碳电极（GCE）表面,再通过Au—S键将巯基修饰的富含鸟嘌呤的dna链（T30695）自组装到电极表面的... 详细信息

制备了金纳米粒子-氧化石墨烯（AuNPs-GO）复合物,采用透射电镜（TEM）和紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）对其进行了表征。将此复合物修饰到玻碳电极（GCE）表面,再通过Au—S键将巯基修饰的富含鸟嘌呤的dna链（T30695）自组装到电极表面的金纳米粒子上。T30695可与Pb;结合形成稳定的平行G-四链体,此G-四链体再与氯化血红素（Hemin）结合形成具有过氧化物酶活性的dna酶（dnazyme）,基于此制得Pb;敏感的dna酶电化学传感器。形成的dna酶可催化H;O;氧化对苯二酚（HQ）,实现电化学信号的放大和Pb;的高灵敏检测。在优化的实验条件下,在5.0×10;～1.0×10;mol/L浓度范围内,传感器的方波伏安（SWV）峰电流与Pb;浓度的对数值有良好的线性关系,检出限为1.0×10;mol/L（S/N=3）。将构建的传感器用于实际水样中Pb;的检测,加标回收率在96%～105%之间。本传感器具有良好的重现性、稳定性和选择性。

关键词：方波伏安法传感器 dna酶铅离子(Ⅱ)

G-四链体-氯化血红素dna酶在传感器设计中的应用

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化学进展 2011年第10期23卷 2119-2131页

作者：孔德明南开大学化学院分析科学研究中心天津300071

G-四链体-氯化血红素(hemin)dna酶是一种由特定的核酸G-四链体与hemin结合后形成的具有过氧化物酶活性的人工模拟酶。作为一类重要的dna酶,G-四链体-hemin dna酶近年来在分析化学领域受到了越来越多的关注。目前这类dna酶已被用在了多... 详细信息

G-四链体-氯化血红素(hemin)dna酶是一种由特定的核酸G-四链体与hemin结合后形成的具有过氧化物酶活性的人工模拟酶。作为一类重要的dna酶,G-四链体-hemin dna酶近年来在分析化学领域受到了越来越多的关注。目前这类dna酶已被用在了多种传感器,包括金属离子传感器、适配体传感器、酶传感器、dna传感器及药物传感器的设计当中。本文对G-四链体-hemin dna酶在传感器设计中的应用进行了系统的介绍和评述,并对其未来的发展进行了初步的展望。

关键词： dna酶 G-四链体氯化血红素传感器过氧化物酶

基于单壁碳纳米管-dna酶复合结构的电化学生物传感器

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高等学校化学学报 2012年第8期33卷 1676-1680页

作者：封科军姚艳玲沈国励俞汝勤惠州学院化学工程系惠州516007 湖南大学化学化工学院化学生物传感与计量学国家重点实验室长沙410082

结合dna酶优异的氧化还原催化特性和碳纳米管的电化学特性,制备了单壁碳纳米管-dna酶复合材料,并通过壳聚糖将其固定到玻碳电极表面构建了电化学生物传感界面.研究了单壁碳纳米管-dna酶复合结构的氧化还原反应催化特性,并以此为传感平... 详细信息

结合dna酶优异的氧化还原催化特性和碳纳米管的电化学特性,制备了单壁碳纳米管-dna酶复合材料,并通过壳聚糖将其固定到玻碳电极表面构建了电化学生物传感界面.研究了单壁碳纳米管-dna酶复合结构的氧化还原反应催化特性,并以此为传感平台构建了葡萄糖氧化酶电化学生物传感器.结果表明,单壁碳纳米管-dna酶复合材料修饰的电极对过氧化氢的响应具有较宽的线性范围(5×10-6～1×10-2mol/L)和良好的检测灵敏度(检出限为1×10-6mol/L).采用制备的葡萄糖氧化酶传感器实现了对葡萄糖的快速灵敏检测.

关键词：碳纳米管 dna酶电化学生物传感器纳米复合材料催化性能