基于LC-MS/MS技术研究全血和血斑蛋白组学差异及其法医学应用探索

作     者：黄傲 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李成涛;刘希玲

授予年度：2023年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 08[工学] 0838[工学-公安技术] 100105[医学-法医学] 10[医学] 

主      题：蛋白组学 全血 血斑 液相色谱串联质谱技术 非标记定量技术 

摘      要：[目的]1.探究形成干燥血斑前后蛋白组学的变化;2.讨论不同储存时间内干燥血斑蛋白质的稳定性;3.验证外周血特异性、年龄相关生物标志物在全血和血斑中的稳定性。[方法]1.根据实验目的选择具有高分辨率、高性能和高稳定性的液相色谱串联质谱技术(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)和非标记定量(label-free quantitative,LFQ)方法。2.经胰蛋白酶处理全血、血斑、血浆和血细胞组织裂解所得的蛋白质样本后进行质谱蛋白组学检测,得到质谱检测的原始文件后,基于样本特异性数据库配对结果进行肽段和蛋白水平的质控分析,然后根据定量结果经R软件limma包对全血和血斑蛋白组学进行组间差异性分析,再对差异蛋白质进行生物学功能、信号通路和亚细胞定位分析,从而探讨蛋白质丰度变化下的潜在机制。3.干燥血斑室温放置0天、10天、20天、1个月、2个月、3个月和6个月后超低温保存。经质谱检测后,对不同放置时间梯度间检测的蛋白质数量和丰度的差异进行统计学分析。4.通过文献检索,分别比较文献报道的12个外周血特异性和13个年龄相关生物标志物在血液和血斑中的稳定性。[结果]1.本研究使用质谱技术从外周血中检测到的肽段总数为7348个,其中特异性肽段7006个,检测蛋白质总数为758个。在错误率不低于1%、蛋白质至少含有一个特异性肽段、以及在至少两组生物学重复中被检测到的条件下,全血、血斑、血浆和血细胞中分别鉴定出623、596、258和485个蛋白质。2.全血和血斑中有572个表达的蛋白质重叠,其皮尔逊相关系数为0.9926,将表达差异倍数设置为1.5倍且校正P值小于0.05为差异蛋白质筛选标准时,有15个蛋白质其丰度在两组间有统计学差异,其中7个在血斑中上调,8个在血斑中下调。3.对储存6个月及以内血斑蛋白组学定性定量结果间的比较表明,血斑蛋白组学较为稳定,不同储存时间组间的皮尔逊相关系数均大于0.99。除了 FKBP1A外,其他蛋白质其丰度随着存储时间均无显著统计学差异。4.外周血特异性和年龄相关生物标志物在基于LC-MS/MS的全血和血斑蛋白质组中的检出率为66.7%和23.1%,可成功检出的标志物其蛋白丰度在全血和血斑中不存在显著差异。[结论]1.经质谱检测血液蛋白组学的方法灵敏度高,在蛋白组学定性定量可重复性好、一致性高,全血与血斑蛋白质丰度具有强相关性,血浆与全血、血斑和血细胞中蛋白组学差异较大。2.在外周血形成干燥血斑时,大部分蛋白质丰度均无显著性改变,其蛋白质丰度的显著性改变可能与细胞内源性蛋白质和结构蛋白的变化相关。3.室温下保存6个月及以内的干燥血斑蛋白组学统计学差异不显著,其质量基本上可满足下游实验以及法医学鉴定的要求。4.外周血特异性生物标志物在全血和血斑中检出率高,蛋白质表达水平稳定,适用于外周血与其他体液的法医学鉴定。年龄相关生物标志物检出率较低,在法医学年龄推断中,建议将其作为一种补充检测方法。