藜麦CqSGAT和CqOSML13基因的克隆及霜霉病菌胁迫下的表达分析

作     者：解宇洁 

作者单位：山西农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李新凤

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：藜麦 CqSGAT基因 CqOSML13基因 基因克隆 qRT-PCR 原核表达 亚细胞定位 瞬时表达 

摘      要：藜麦(Chenopodium quinoa Willd),属藜科藜属一年生草本植物,是一种全营养单体植物,藜麦霜霉病(Peronospora variabilis Gaüm)是各藜麦产区常见的病害,严重影响藜麦的产量和品质,给藜麦产业造成了较大经济损失。因此,筛选藜麦抗霜霉病基因,明确藜麦抗霜霉病的防御机制,进而选育抗病品种,对藜麦霜霉病的防治具有重要的理论和现实意义。基于此,本研究通过同源比对获得藜麦抗霜霉病候选基因,结合半定量RT-PCR和qRT-PCR筛选了在藜麦霜霉病菌胁迫下、抗感材料之间具有表达差异的基因CqSGAT和CqOSML13。在克隆CqSGAT和CqOSML13 CDS序列的基础上,构建了原核表达载体,获得了重组蛋白His-CqSGAT和His-CqOSML13,并验证其体外抑菌活性,构建CqOSML13基因的瞬时表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草和藜麦叶片,以探究CqSGAT和CqOSML13在藜麦抗霜霉病防御反应中的功能。主要研究结果如下:1.通过ge Norm、Norm Finder、Best Keeper和Ref Finder 4个软件分析CqRPS18、CqUBC、CqTUA-1、CqELF3、CqACT1、CqTUB-6、CqEF-1α和CqMON1共8个候选内参基因在藜麦霜霉病菌胁迫下的表达稳定性,各软件分析结果均显示,藜麦在霜霉病菌胁迫下稳定表达的最适内参基因为CqEF-1α。2.经同源比对共获得28个藜麦抗霜霉病的候选基因,霜霉病菌侵染后,除CqSGAT和CqOSML13基因在抗感材料中的表达量有明显差异外,其余26个基因在不同供试材料中的表达量变化不大。CqSGAT和CqOSML13在抗病叶片中的表达量均高于在感病叶片中的表达量。霜霉病菌侵染后,CqSGAT基因在74421中的表达量变化很小,在2403中的表达量波动上升,12 h达到峰值,之后逐渐下降。CqOSML13基因在74421中的表达量在侵染后逐渐上升,12 h达到峰值,后逐渐下降;在2403中的表达量在侵染后显著上升,2 h达到峰值,之后略有下降,但在48 h内仍保持较高的表达水平,在72 h显著降低。因此霜霉病菌侵染可以激活CqSGAT和CqOSML13基因的表达,推测CqSGAT和CqOSML13基因参与藜麦抗霜霉病的防御反应,可作为藜麦抗霜霉病的候选基因。3.供试藜麦抗感材料中均存在高度保守的CqSGAT和CqOSML13 CDS序列,CqSGAT基因CDS序列为1206 bp,编码401个氨基酸,预测分子量为43.99 k Da,CqSGAT蛋白不含信号肽和跨膜结构域,属于膜外非分泌蛋白,预测亚细胞定位于过氧化物酶体;CqOSML13基因CDS序列为669 bp,编码222个氨基酸,预测分子量为23.27k Da,CqOSML13蛋白有信号肽但无跨膜结构域,属于经典分泌蛋白。4.通过构建原核表达载体p ET28a-SGAT和p ET28a-OSML13,获得了带有His标签的His-CqSGAT(47.38 k Da)和His-CqOSML13(26.79 k Da)重组蛋白,两个蛋白在上清和沉淀中均可表达。His-CqSGAT重组蛋白IPTG诱导的最适浓度为1 mmol/L,最佳咪唑洗脱浓度为250 mmol/L;His-CqOSML13重组蛋白IPTG诱导的最适浓度为1mmol/L,最佳咪唑洗脱浓度为200 mmol/L。5.重组蛋白His-CqSGAT和His-CqOSML13对藜麦灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)无体外抑菌活性;瞬时表达载体p CAMBIA1300-EGFP-OSML13经农杆菌介导烟草叶片后,CqOSML13蛋白定位在细胞膜、细胞质和细胞核内;霜霉病菌侵染后注射p CAMBIA1300-EGFP-OSML13瞬时表达载体的74421叶片与对照组叶片相比,发病面积较小,推测CqOSML13基因参与藜麦抗霜霉病的防御机制。