用于角质酶的多功能类弹性蛋白多肽标签：从简单制备到增强对PET的生物降解

作     者：袁航 

作者单位：华侨大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张光亚

授予年度：2023年

学科分类：08[工学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 080502[工学-材料学] 

主      题：聚对苯二甲酸乙二醇酯 类弹性蛋白多肽 角质酶 亲和力 酶法降解PET 固定化酶 

摘      要：聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是最受欢迎的合成聚酯之一,它是由乙二醇（EG）和对苯二甲酸（TPA）制成的聚合物。由于其耐久性,它被广泛用于饮料瓶、包装材料和纺织纤维和许多其他领域,给人类生活带来极大便利。然而,一旦进入环境,PET变得易碎,分解成更小的碎片,形成微/纳米塑料（5毫米）,进入食物链,对海洋和人类生命造成危害,对全球生态系统造成严重问题。酶法降解技术因其环境友好性和低能耗被认为是解决塑料降解的一种有吸引力的方法,但也面临着一些尚未解决的挑战,如酶制备和再利用成本高且复杂,酶与PET接触困难,并且有中间产物抑制,纳米PET（Nano PET）目前无法从市面上购买得到等问题。为了解决上述问题,本论文主要展开以下工作:首先,提出了一种“一体化的策略,即以角质酶（突变体WCCG）为模型酶,与类弹性蛋白多肽（ELPs）标签构建融合蛋白（ET-C）来实现PET高效降解。利用ELPs作为纯化标记,通过简单离心可大规模制备角质酶,其活性回收率为57.55%,产量为160 mg/L。并且,设计良好含有疏水性和芳香族氨基酸残基的ELPs,可以通过疏水和π-π相互作用改善角质酶-PET的相互作用,从而提高PET的生物降解效率。与没有ELPs标记的角质酶相比,ELPs标记的角质酶降解微塑料的活性提高了1.3倍,降解大颗粒塑料时活性提高了1.66倍。此外,通过ELPs介导的生物硅化获得自固定化角质酶（ET-C@SiO）。SEM-Mapping,EDS,CLSM,FTIR和TGA结果相互验证,表明ET-C成功固定化在二氧化硅上。ET-C@SiO表现出较高的负载量、活性和热稳定性,并且在重复使用10次后保持77.65%的原始活性。更令人鼓舞的是,带ELPs标签的角质酶（ET-C）降解PET的产物为TPA,这是由于融合ELPs轻微改变了酶的活性口袋,而野生型角质酶产物为TPA和MHET。与现有方法相比,这是一种简单的消除MHET抑制的方法。其次,建立了一种基于ELPs仿生矿化制备包磁二氧化硅的酶固定化方法,将其用于降解纳米塑料。首先,利用ELPs-（K5V4F）仿生矿化合成生物相容的磁性纳米粒子（ELPs-MNPs）作为磁芯。然后将ET-C与ELPs-MNPs纳米粒子充分混合,加入硅前体（TEOS）,ELPs介导生成二氧化硅包覆表面,同时实现角质酶的自固定化（ET-C@SiO@MNPs）,整个过程仅需31分钟。SEM-Mapping,EDS,FTIR,VSM和TGA结果相互验证,表明二氧化硅包覆在磁性纳米粒子上且ET-C成功自固定化。ET-C@SiO@MNPs能在30秒内完成磁分离,效果良好,简化了固定化酶的回收与再利用。与游离酶相比,固定化酶热稳定性拥有较明显的优势,并且磁分离11次后,仍保持86%的原始活性。由于纳米PET（Nano PET）目前无法从市面上购买得到,采用一种简单、快速和有效的方法来制备:以微塑料PET作为原料,用三氟乙酸处理后超声沉降制得Nano PET。SEM、FTIR和DLS结果证明Nano PET的成功制备,且尺寸分布为297±43 nm。将ET-C@SiO@MNPs用于降解Nano PET,1.5小时后,可得到0.00385 mg BHETeq,其降解速率为游离酶的94.8%。本论文基于多功能ELPs提出了一种一体化策略,解决酶法降解PET中出现的问题,为PET降解和循环利用铺平了一条经济、可扩展的道路,这有助于推动PET降解研究从实验室走向实际应用。