ACSL3对小鼠脂肪沉积作用的初步研究

作     者：张清昱 

作者单位：重庆理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄奎龙;林治华

授予年度：2024年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：肥胖 脂肪生成 ACSL3敲除小鼠 虚拟筛选 活性验证 

摘      要：背景:我国肥胖患病率增长迅速,已成为全球肥胖人口最多的国家之一。随着肥胖及其相关代谢性疾病患者数量的显著增加,肥胖的治疗变得日益重要。脂肪作为身体主要能量来源之一,是重要的能量储存物质。然而,当脂肪代谢失调时,可能导致一系列健康问题,例如肥胖、2型糖尿病和心血管疾病等。长链脂酰辅酶A合成酶3(ACSL3)是ACSL家族的一员,广泛分布于脂肪组织中,通过活化脂肪酸影响脂肪酸的β-氧化和甘油三酯的合成,对机体脂肪代谢起着至关重要的作用。有研究表明过表达ACSL3会引起脂滴增多,然而目前ACSL3调控脂肪生成的机制还不完全清楚。因此,研究ACSL3对脂肪沉积的作用可以为治疗肥胖提供潜在的新靶点。 目的:通过建立ACSL3基因敲除小鼠模型以及干扰ACSL3的3T3-L1稳转细胞系,在体内外两个层面明确ACSL3基因对脂肪形成的影响,为肥胖治疗提供潜在靶点。同时,通过虚拟筛选和分子动力学模拟方法,寻找针对ACSL3的靶向化合物,为开发针对肥胖的靶向药物提供新的治疗策略和科学依据。 方法: (1)建立干扰ACSL3表达的3T3-L1稳转细胞系,从ACSL3基因敲除小鼠腹股沟白色脂肪组织提取原代前体脂肪细胞。通过5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(Ed U)检测细胞增殖状态,同时通过蛋白质印记法(WB)和实时荧光定量法(RT-q PCR)检测增殖相关基因的蛋白和m RNA的表达,评估ACSL3对脂肪细胞增殖的影响。 (2)将两种细胞诱导分化成脂,通过油红O染色观察脂滴的生长状况。同时,通过WB和RT-q PCR检测成脂相关基因的蛋白和m RNA的表达,评估ACSL3对脂肪细胞分化的影响。 (3)在高脂饲喂和正常饲喂的条件下,通过检测小鼠体重变化、葡萄糖耐受情况和胰岛素耐受情况,评估敲除ACSL3对小鼠代谢的影响。通过HE染色观察组织形态学的变化,来评估敲除ACSL3对小鼠代谢的影响。 (4)通过检测小鼠白色脂肪组织和肝脏组织中成脂相关基因的蛋白和m RNA的表达,评估敲除ACSL3在体内对脂肪生成的影响。 (5)通过虚拟筛选和分子动力学模拟针对ACSL3筛选小分子化合物,通过CCK-8计算其IC50值,并利用IC50值设置浓度梯度验证小分子的抗脂肪生成活性。 结果: (1)在干扰ACSL3表达的3T3-L1稳转细胞系和从ACSL3基因敲除小鼠腹股沟白色脂肪组织提取的原代细胞中,增殖相关基因的蛋白和m RNA表达没有显著变化。 (2)干扰ACSL3导致3T3-L1脂肪细胞分化后脂滴量显著下降,成脂相关基因的蛋白和m RNA表达显著下调。 (3)在正常饲喂情况下,ACSL3基因敲除鼠体重与野生小鼠没有显著差异,但在高脂饲喂后,ACSL3基因敲除敲除鼠体重显著降低,但正常饲喂情况下和高脂饲喂下葡萄糖耐量和胰岛素耐受能力均没有差异。HE染色观察到,敲除ACSL3导致脂肪组织脂滴减小甚至破裂,而在肝脏中没有显著的变化。 (4)敲除ACSL3导致成脂相关基因的蛋白和m RNA表达显著降低。然而,在脂肪组织中AKT的磷酸化被显著抑制,而这种抑制在肝脏中并未被检测到。 (5)筛选得到可以抑制ACSL3的两个化合物,分别为44603533和25167777。CCK-8测得两个化合物对3T3-L1细胞的IC50值分别为1.129μM和0.125μM。油红O染色结果显示25167777能够减少脂滴的生成。 结论:本研究指出ACSL3不参与脂肪细胞增殖的调控,但在脂肪细胞分化过程中具有重要作用。ACSL3可能通过影响脂肪细胞中AKT的磷酸化来调控脂肪生成,为肥胖的治疗提供了潜在靶点。此外,发现25167777可能通过抑制ACSL3的表达而抑制了3T3-L1细胞的分化成脂,初步寻找到了可以与ACSL3互作的化合物,为ACSL3抑制剂的开发提供了新思路。