水稻条斑病菌缺磷胁迫蛋白组分析与磷酸盐代谢关键基因功能研究

作     者：杨夏 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何勇强

授予年度：2020年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：水稻条斑病菌 缺磷 差异蛋白组 phoBR 表型 致病力 

摘      要：水稻条斑病菌(Xanthomonas campestris ***,Xoc)是一种重要的植物病原细菌,它能引起水稻条斑病,从而侵染水稻,造成水稻严重减产和品质下降。水稻条斑病主要发生在热带及亚热带地区,是我国南方稻作区的重要病害,两广地区尤为严重。水稻条斑病菌的致病能力除了依赖自身的致病因子,也与其所处环境密切相关。它可以通过适应环境的变化来定殖在宿主水稻上,尤其是与营养成分的变化有关,能够影响致病因子的表达。无机磷酸盐(Inorganic phosphate,Pi)是水稻条斑病菌必需的营养元素,在信号转导和能量代谢中起重要的作用。它的摄取主要由磷酸盐特异性转运系统(Phosphate-specific transport system,Pst)完成。而Pst系统由双组份调控系统pho BR控制,pho R通过磷酸化和去磷酸化来调节pho B的活性,启动或抑制与磷酸盐转运相关的基因表达。目前,与水稻条斑病菌侵染、致病相关的功能基因研究比较多,而关于水稻条斑病菌的磷酸盐代谢调控研究鲜有报道。本研究以广西水稻条斑病菌分离株Xoc GX01为研究对象,通过蛋白质组学的方法分析缺磷胁迫条件下Xoc GX01的变化,初步确认与磷代谢相关的蛋白和基因,并研究磷酸盐代谢关键基因pho B和pho R的功能。本文研究结果如下:1、通过i TRAQ蛋白质组学分析足磷、缺磷下Xoc GX01的蛋白质差异表达,共有252个差异蛋白,其中212个蛋白质表达上调,40个蛋白质表达下调。差异蛋白主要涉及核糖体蛋白合成、双组份调控系统、细胞膜、磷酸代谢、精氨酸的生物合成、信号转导等,有与鞭毛、Ⅳ型菌毛、Ш型分泌系统、粘附素相关的蛋白。利用Centiscape分析差异蛋白中的关键蛋白,其中与磷酸盐特异性系统相关的Pho B蛋白,表达上调。通过BLASTP与大肠杆菌的pho调控元比对,发现Xoc GX01中至少有22个基因与大肠杆菌的pho调控元基因同源,在差异蛋白质中与pho调控元相关的蛋白有与磷酸酯转化相关的XOCgx＿0834、Pdx H,与磷酸盐特异系统相关的Pho B、Pho U、Pst C,与三磷酸甘油酯相关的XOCgx＿2155蛋白以及孔蛋白Opr O＿P。2、利用同源双交换方法对pho B的REC结构域进行缺失突变,突变体命名为pho B(ΔREC)。对课题组突变体库中,pho B、pho R、pho BR缺失突变体进行了验证,单基因pho R、pho B缺失突变体分别命名为DMpho R、DMpho B,双基因pho BR缺失突变体命名为DMpho BR。通过重组质粒导入野生型,构建过表达菌株GX01(p Jpho R)、GX01(p Jpho B)。以野生型Xoc GX01作为对照,对这些相关突变体和过表达菌株进行生化表型、致病力等检测。结果如下:过表达菌株GX01(p Jpho R)、GX01(p Jpho B)的胞外蛋白酶、胞外多糖、生物膜以及致病力与野生型均无显著差异。相较于Xoc GX01,DMpho R、DMpho B、DMpho BR、pho B(ΔREC)均使得胞外蛋白酶活性显著下降。DMpho R的胞外多糖减少,而DMpho B、DMpho BR、pho B(ΔREC)的胞外多糖无显著变化。DMpho R、DMpho B、DMpho BR以及pho B(ΔREC)的游动性与野生型一致。DMpho R、DMpho B、DMpho BR、pho B(ΔREC)均使得生物膜形成能力下降。DMpho R、DMpho B、DMpho BR、pho B(ΔREC)均使得致病力减弱。且通过反式功能互补方法构建各突变体的互补菌株,均能补回至野生型。表明pho BR能通过致病因子胞外蛋白酶、生物膜形成能力等来影响菌株Xoc GX01侵染宿主的能力。3、通过测定各突变体在足磷、缺磷条件下的生长曲线,DMpho R、DMpho B和DMpho BR的生长相对于野生型Xoc GX01来说均变慢,说明pho BR是Xoc GX01在环境中生存的重要基因。通过q RT-PCR分析,Xoc GX01在缺磷胁迫下,pho B、pho R、pho U、pst S的m RNA表达量升高。通过FIMO(Find Individual Motif Occurences)软件分析,发现与Ш型分泌系统、鞭毛等致病因子相关的靶标,并与蛋白质组差异蛋白进行比对,发现在缺磷条件下,Xoc GX01中Pho B参与调控的相关因子涉及DNA结合、蛋白质翻译修饰等。综上所述,本研究通过上述技术策略,探讨在足磷、缺磷不同条件下,水稻条斑病菌Xoc GX01蛋白质的差异表达,以此来分析与磷酸盐代谢相关的蛋白。并对其中调控磷酸盐的关键基因pho B所在的双组份调控子p