GLP-1R基因敲除的THP-1细胞系建立及其功能研究

作     者：王文文 

作者单位：湖北医药学院 

学位级别：硕士

导师姓名：程立

授予年度：2023年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：CRISPR/Cas9 GLP-1R THP-1 基因敲除 极化 

摘      要：背景:巨噬细胞具有高度异质性和可塑性。在不同系统中不同的疾病或同一疾病的不同阶段,巨噬细胞可以发生表型变化,从而履行不同的功能。随着研究的深入,胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)在调控巨噬细胞迁移及表型分化等方面发挥着一定作用。目的:通过Cas9慢病毒介导的方法构建GLP-1R基因稳定敲除THP-1细胞系,探究GLP-1R表达对巨噬细胞迁移、极化的影响。方法:通过构建对GLP-1R基因的特异性打靶慢病毒载体,建立GLP-1R-/-THP-1细胞系,使用嘌呤霉素进行筛选,克隆后通过基因测序和蛋白印迹实验(Westem blot,WB)进行鉴定。根据构建结果对不同细胞分类:野生型组(WT组):THP-1细胞;GLP-1R-/-组(KO组):GLP-1R-/-THP-1细胞。分别用佛波酯(PMA)、干扰素γ(INF-γ)+脂多糖(LPS)、白介素4(IL-4)刺激WT组、KO组,进一步构建WT组、KO组MO、M1、M2型巨噬细胞模型。流式检测细胞表面分子CD14、CD80、CD206 的表达;qRT-PCR检测 CD68、IL-6、TNF-α、iNOS、IFN-γ、IL-10、CD206、CD163、Arg-1 mRNA的表达。Transwenll和划痕实验检测GLP-1R对巨噬细胞的迁移情况;结果:(1)基因测序及WB结果证实,GLP-1R-/--THP-1细胞系构建成功:(2)流式细胞术结果显示:M0型巨噬细胞高表达CD14+,M1型高表达CD14+CD80+;M2型高表达CD14+CD206+;(3)qRT-PCR结果显示:与WT组相比,用PMA诱导得到WT M0的CD68 m RNA表达显著上调(P0.001)。与KO组相比,用PMA诱导得到KO M0的CD68 mRNA表达显著上调(P0.05)。与WT组相比,KO组诱导得到的巨噬细胞中,M 1型巨噬细胞标志物mRNA表达明显升高,M2型巨噬细胞标志物mRNA表达显著降低。(4)GLP-1R能够影响巨噬细胞的迁移;结论:本研究通过Cas9慢病毒成功构建了一株GLP-1R基因敲除的THP-1细胞系,并通过对不同细胞系的诱导分化研究得出GLP-1R基因缺乏可诱导巨噬细胞分泌促炎因子,向M1型巨噬细胞极化。GLP-1R可促使巨噬细胞分泌抗炎因子,向M2型巨噬细胞极化。