异补骨脂素通过下调YAP信号通路抑制胶质母细胞瘤的进展

作     者：王梦梦 

作者单位：杭州师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄智慧;姜远远

授予年度：2023年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：异补骨脂素 GBM YAP 增殖 细胞周期 迁移 

摘      要：背景:胶质母细胞瘤(GBM)是成人中枢神经系统最具侵袭性和最常见的肿瘤之一。替莫唑胺是临床上治疗GBM的一线用药,但耐药性的出现大大降低了其临床疗效。GBM患者仍表现为低生存率和高复发率。异补骨脂素是一种呋喃香豆素类活性化合物,已在多种癌症中表现出抗癌活性。然而,异补骨脂素是否具有治疗GBM的作用及其作用机制仍不清楚。YAP是受Hippo信号通路负调控的转录共因子,通过与转录因子结合调控相应靶基因,进而控制细胞增殖,细胞周期以及细胞迁移等活动。在胶质瘤中,YAP表现出促癌活性。但是异补骨脂素是否能通过YAP信号通路调节GBM生长也仍待探究。目的:本研究拟通过体外和体内实验探究异补骨脂素是否具有抗GBM活性及其作用机制。方法:(1)以GBM细胞系U251和C6为对象,采用CCK-8实验,PH3染色以及细胞克隆形成实验探究异补骨脂素对细胞增殖的影响;并在原代培养的星形胶质细胞上实施CCK-8实验检测了异补骨脂素对正常细胞活力的影响;(2)采用流式细胞术以及western blotting技术探究异补骨脂素对细胞周期的作用;(3)采用划痕实验以及transwell实验探究异补骨脂素对细胞迁移的影响;(4)采用western blotting以及细胞免疫荧光实验探究异补骨脂素对YAP信号通路的影响;(5)在U251上构建YAP的过表达细胞株,通过PH3染色、western blotting以及划痕实验探究过表达YAP对异补骨脂素抗癌作用的影响;(6)通过免疫组织化学、western blotting以及HE染色技术探究异补骨脂素在GBM裸鼠皮下异种移植模型以及C57BL/6同系原位GBM模型中的作用及其机制。结果:(1)CCK-8结果表明异补骨脂素以时间依赖性以及浓度依赖性的方式抑制U251和C6细胞的活力,且对正常细胞毒性较小;PH3染色以及细胞克隆实验也表明异补骨脂素显著地抑制了U251和C6细胞的增殖;(2)流式细胞术的结果显示用异补骨脂素处理后,U251和C6细胞中G1期细胞的比例显著增加;与流式结果相吻合,western blotting的结果显示Cyclin D1下调,P21上调。这表明异补骨脂素可诱导U251和C6细胞的细胞周期阻滞在G1期;(3)划痕实验和transwell实验结果表明随着异补骨脂素浓度的升高,细胞迁移能力不断下降;(4)Western blotting结果显示异补骨脂素降低了YAP的表达,同时也影响到了Hippo通路上的相关激酶以及下调了β-catenin的水平;YAP的细胞免疫荧光实验表明用异补骨脂素处理后,不仅YAP的平均荧光强度下降,而且具有YAP核定位的细胞的比例明显减少,即YAP入核受到抑制;(5)PH3染色、western blotting以及划痕实验表明过表达YAP后,部分回补了异补骨脂素对U251细胞增殖抑制,周期阻滞以及迁移抑制作用;(6)在GBM裸鼠皮下异种模型以及小鼠原位GBM模型中,异补骨脂素均能下调肿瘤YAP的表达,抑制GBM的发生发展,且对重要器官并未表现出明显的毒副作用。结论:异补骨脂素通过下调YAP信号通路抑制GBM的增殖,诱导细胞周期阻滞在G1期,抑制迁移,有望成为治疗GBM的新的潜在药物。