代谢组学及蛋白组学分析髌下脂肪垫在膝关节骨关节炎中的作用及机制
作者单位：河南大学
学位级别：硕士
导师姓名：郑稼
授予年度：2023年
摘 要：背景:膝关节骨关节炎(osteoarthritis,OA)是临床最常见的骨关节疾病之一,主要表现为疼痛和关节活动受限,晚期会出现关节畸形。OA的病因和危险因素主要包括创伤、年龄、肥胖、性别和遗传。在OA的进展中,整个关节内不同组成结构均受影响,病理表现为软骨退变、骨赘形成、软骨下骨硬化、滑膜及髌下脂肪垫(Infrapatellar Fat Pad,IPFP)变性。OA的治疗主要包括早期口服非甾体类药物和晚期行关节置换术,但由于缺乏针对病因的治疗药物、关节假体寿命及手术并发症等问题存在,OA患者依然承受着很大的负担。IPFP作为膝关节内的重要组分,近年来越来越多的研究开始重视它在OA中的作用。因此,探索IPFP在OA中的作用及机制对于全面理解OA和寻找新的治疗靶点具有重要的临床意义。目的:对OA组和对照组的IPFP进行代谢组学和蛋白组学分析,找出差异表达代谢物(Differential Expressed metabolites,DEMs)和差异表达蛋白质(Differential Expressed proteins,DEPs),并对它们进行生物信息学分析找出OA中IPFP发生的病变机制,最后找出这些DEMs和DEPs均富集的重要通路并探索其对OA发生发展的影响。方法:1、第一部分:选取2022年1月至2022年10月于河南省人民医院因OA行全膝关节表面置换术(Total Knee Arthroplasty,TKA)和因半月板损伤行半月板成形术(Meniscoplasty)的患者,术中获取IPFP样本,并收集患者年龄、性别、BMI信息,采用液相色谱质谱联用(Liquid Chromatograph Mass Spectrometer,LC-MS)技术比较OA组(n=28)和对照组(n=17)的IPFP代谢图谱,使用正交偏最小二乘辨别分析(OPLS-DA)模型筛选IPFP中的DEMs,并对DEMs进行KEGG通路分析。2、第二部分:样本收集方法同第一部分,采用Label-free定量蛋白质组学技术,比较OA组(n=8)和对照组(n=8)患者IPFP的蛋白图谱,筛选出DEPs,并对DEPs进行基因本体论(Gene ontology,GO)与京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析,最后构建蛋白互动网络(Protein protein interaction,PPI)和Hub节点分析。3、第三部分:样本收集方法同第一部分,联合DEMs与DEPs分析,寻找两者均富集的重要通路,最终选择了糖酵解通路进行研究;western blot实验验证糖酵解通路中的关键蛋白表达情况;利用乳酸试剂盒比较OA组(n=8)和对照组(n=8)患者IPFP乳酸值的变化来验证组间糖酵解过程的差异;最后利用乳酸处理软骨细胞后,western blot实验检测Collagen II、Aggrecan、Collagen X、MMP13这4个软骨退变标志物的变化。结果:1、本研究鉴定出147个DEMs,KEGG通路分析结果发现DEMs主要富集了癌症中的碳代谢、胰岛素信号传导途径、氨基酸合成代谢、糖代谢等物质代谢有关的通路。2、本研究鉴定出516个DEPs,GO富集分析结果显示DEPs关于生物过程(Biological Process,BP)显著富集了补体激活,经典途径、柔红霉素代谢等;关于细胞成分(Cel Glular Component,CC)显著富集了血液微粒子、细胞外空间等;关于分子功能(Molecular Function,MF)显著富集了醛醇:NADP+1-氧化还原酶活性、D-苏糖醛糖1-脱氢酶活性、抗原结合等;KEGG分析结果提示DEPs主要富集了代谢途径、系统性红斑狼疮、原发性免疫缺陷;除此之外,DEPs在糖、氨基酸、脂类代谢有关的通路中也存在富集。蛋白质互动网络(PPI)和HUB节点分析,找到了连接度前10的蛋白质(ENO1、CAT、APOA1、HSPE1、FBL、UQCRC1、PPIF、TTR、TARDBP和C1QBP)作为IPFP在OA中的关键蛋白。3、通过对DEPs和DEMs的联合分析,选择了糖酵解通路进行研究。在糖酵解通路网络中PGM1、PGK1、PGAM1、EN01这4个DEPs存在与DEMs的直接作用关系;Western blot结果发现PGM1、PGAM1、EN01蛋白质在OA组IPFP中为高表达;乳酸试剂盒测量的乳酸值结果提示OA组的IPFP含有更高的乳酸值;利用乳酸处理软骨细胞,Western blot结果发现Collagen II、Aggrecan表达降低,Collagen X、MMP13表达增高。结论:1、通过代谢组学和蛋白组学分析,找到了OA发展过程中IPFP存在的DEMs和DEPs,并进行了生物信息学分析,找到了一些与病变相关的关键蛋白和信号通路。2、糖酵解途径在OA的IPFP中存在增强,其造成的酸性环境能够造成软骨的退变,同时也找到了PGM1、PGAM1、EN01这3个糖酵解通路中的关键蛋白,糖酵解的紊乱有助于从新的角度理解OA的发生机制。
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